抗生素及其耐药性在畜禽粪便-土壤-蔬菜中的传播和转移

摘要

畜牧养殖业中抗生素的长期使用，会导致抗生素残留、动物肠道产生的抗生素耐药细菌、耐药基因伴随粪便排泄及粪肥施用进入养殖区域和农田土壤。由此引发的抗生素耐药性在土壤-植物中的传播和扩散问题已经引起人们的广泛关注。相对于抗生素的环境可降解性和耐药细菌的环境适应性问题，耐药基因由于具有水平转移和难生物降解的特点，可以在环境中持续留存和转移，进而导致细菌多重耐药性产生甚至“超级细菌”的出现，为临床医学带来巨大挑战。因此，耐药基因已被人们视为一种新型的环境污染物。畜禽粪便作为重要的抗生素耐药细菌和耐药基因储库，其施用于农田，会促进土壤微生物耐药性增强，然而，耐药细菌、耐药基因能否进入植物通过食物链传播，相关研究还少有报道。本研究调查了畜禽粪便和施肥土壤中抗生素的残留浓度、耐药基因的分布特点和丰度水平，模拟了农村传统的动物粪便简单堆肥处理过程，追踪了抗生素耐药性在堆肥过程中的动态变化。进一步采用盆栽实验方法，分别在抗生素暴露、粪肥、耐药菌群暴露的环境下栽种蔬菜，通过高通量测序、培养计数手段分析蔬菜内生抗生素耐药细菌的群落变化，同时结合定量PCR技术追踪蔬菜内生细菌中抗生素耐药基因的丰度改变，初步阐明了环境中的抗生素耐药性由畜禽粪便向土壤、蔬菜传播的机制问题。主要创新性研究结果总结如下:
　　1.畜禽粪便和施肥土壤的抗生素残留及耐药基因污染
　　利用ASE-UPLC/MS检测了14种常用抗生素在畜禽粪便及土壤中的残留情况，除常年未施粪肥的土样未测出药物残留外，其它所有样品均同时存在抗生素残留。鸡粪中抗生素药物的平均浓度为3.01～2253.66μg kg-1，猪粪中残留抗生素的平均水平在3.14～12143.77μg kg-1，施肥土壤中药物浓度在5.69～195.17μg kg-1，低于粪便样品。另外，功能基因芯片GeoChip检测发现，不论是否施肥，土壤中的耐药基因数量、类群多样性都高于鸡粪样品。进一步定量检测耐药基因的丰度发现，鸡粪中耐药基因丰度最高，未施肥土中耐药基因丰度最低，说明鸡粪施肥可以增加土壤中耐药基因的丰度水平。
　　2.简单堆肥过程中抗生素耐药性的动态变化
　　调查了14种抗生素、15种抗生素耐药基因和多重抗生素耐药细菌在鸡粪、猪粪简单堆肥过程中的变化情况。在60天的堆肥周期中，除个别有较高初始浓度的抗生素持续留存外，物料中多数药物的浓度水平大幅下降。细菌培养计数结果显示，堆肥结束后物料中可培养多重耐药细菌的丰度下降了两个数量级，但是其在总可培养细菌中的比例却分别从0.35％上升到1.8％(鸡粪)、0.08％上升到0.45％(猪粪)。对于定量检测的15种耐药基因而言，60天堆肥处理结束后多数基因的相对丰度下降1～2个数量级，但是鸡粪中的tetA、tetM、sul2基因，猪粪中的sul1、qnrD、aacC2、mefA基因水平上升，其相对丰度分别达到初始水平的2-100倍。
　　3.抗生素暴露对蔬菜内生细菌耐药性的影响
　　设计了一系列水培实验，分别在四环素、头孢氨苄、磺胺甲恶唑以50％MIC值和MIC值水平的暴露剂量下栽种小白菜，并调查了植物生长、抗生素吸收和蔬菜内生系统抗生素耐药性的变化。结果显示，三种药物均可被小白菜吸收，且在50％MIC值的暴露剂量下可以促进植株生长。随着植株中抗生素的积累，耐药内生细菌的比例从对照处理的0.23％、3.77％和1.26％增加到0.70～1.23％、6.41～8.29％和6.00～7.43％。定量PCR检测证实，与三种暴露抗生素的耐药性相对应的tetX、blaCTX、sul1和sul2基因存在于小白菜内生系统中，其丰度随着抗生素暴露剂量的增加而增加。
　　4.粪源多重耐药细菌和耐药基因通过土壤-植物根际向蔬菜内生系统的转移和定植
　　采用盆栽实验，在添加粪源多重耐药菌群、鸡粪肥或有机肥的土壤中分别栽种小白菜和生菜，与对照处理相比，处理组蔬菜的内生系统中对四环素、庆大霉素、红霉素同时耐药的多重耐药细菌的丰度上升了1-2个数量级。比较不同处理的蔬菜样品中内生细菌的群落结构发现，Pseudomonas sp.和Alcaligenes sp.可能是能够从土壤环境进入植株内部定植的细菌类群，存在从粪便-土壤-蔬菜传播抗生素耐药性的风险。蔬菜内生系统中耐药基因的定量检测进一步证实，在土壤中无论是添加耐药菌群或是粪肥，都能促进蔬菜内生系统抗生素耐药基因丰度的增加，且多重耐药菌群的影响作用更加显著。

目录

摘要

1．1．1 概述

1．1．2 环境中抗生素的来源

1．1．3 环境中抗生素的污染现状

1．1．4 环境中抗生素污染引发的问题

1．2 农田生态系统中的抗生素污染及耐药性传播

1．2．1 抗生素在农牧业生产中的应用

1．2．2 抗生素进入农田生态系统的途径

1．2．3 抗生素在农田生态系统中的迁移转化

1．2．4 粪源抗生素耐药性及其在土壤环境中的传播

1．3 抗生素及其耐药性在植物中的传播对农作物的影响

1．3．1 植物对抗生素的吸收

1．3．2 抗生素对植物的生态毒性

1．5 环境样品中抗生素耐药基因的研究方法

1．6 研究目的及意义

第二章 畜禽粪便和施肥土壤的抗生素残留及耐药基因污染

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 化学试剂和标准品

2．2．2 样品选择

2．2．3 抗生素提取及分析

2．2．4 DNA提取，纯化及GeoChiP分析

2．2．5 耐药基因的定量分析

2．2．6 统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 畜禽粪便及土壤中的抗生素残留

2．3．2 畜禽粪便及土壤中的抗生素耐药功能基因多样性

2．3．3 畜禽粪便及土壤中抗生素耐药基因的丰度

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 简单堆肥过程中抗生素耐药性的动态变化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 化学试剂及标准品

3．2．2 堆肥试验

3．2．3 抗生素检测

3．2．4 总可培养异养细菌及多重耐药细菌计数

3．2．5 DNA提取和PCR检测耐药基因

3．2．6 耐药基因的定量分析

3．3 结果与分析

3．3．1 堆肥过程中抗生素的降解

3．3．2 堆肥对总可培养异养细菌和多重耐药细菌的影响

3．3．3 堆肥过程中耐药基因的丰度变化

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 水培条件下抗生素暴露对蔬菜内生细菌耐药性的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 化学试剂

4．2．2 水培实验过程

4．2．3 生长参数的测量

4．2．4 抗生素分析

4．2．5 计数总可培养内生细菌和抗生素耐药内生细菌

4．2．6 DNA提取，PCR检测和耐药基因的定量分析

4．2．7 数据处理及统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 抗生素暴露对小白菜生长的影响

4．3．2 小白菜对抗生素的吸收

4．3．3 抗生素暴露对小白菜中耐药内生细菌的影响

4．3．4 小白菜内生系统中抗生素耐药基因的丰度

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 粪源多重耐药细菌和耐药基因通过土壤-植物根际向蔬菜内生系统的转移和定植

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 抗生素及供试蔬菜

5．2．2 多重耐药细菌、鸡粪、有机肥及土壤样品

5．2．3 盆栽实验过程

5．2．4 计数蔬菜中总可培养内生细菌及多重耐药内生细菌

5．2．5 蔬菜及土壤样品中可培养多重耐药细菌的鉴定

5．2．6 蔬菜及土壤样品总DNA提取及高通量测序分析

5．2．7 耐药基因定量分析

5．3 结果与分析

5．3．1 添加粪肥或抗生素耐药菌群对蔬菜内生耐药细菌的影响

5．3．2 蔬菜及土壤中的多重耐药细菌

5．3．3 蔬菜内生细菌的群落结构

5．3．4 蔬菜内生系统中抗生素耐药基因的丰度

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 研究结论及展望

6．1 研究结论

6．2 研究展望

参考文献

致谢

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