西瓜根结线虫抗性相关基因同源序列的克隆与分析

摘要

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.) Manf.）是一种世界性的园艺作物，在世界十大果品中名列第五，占有十分重要的地位，然而栽培西瓜容易受到各种病原物如根结线虫、枯萎病、病毒病等的侵染，随着近年来温室西瓜栽培面积的扩大及受连作栽培制度的限制，西瓜受根结线虫的危害愈加严重。由根结线虫侵染所引起的西瓜根结线虫病害是一种世界性的西瓜病害，目前防治西瓜根结线虫病害的主要途径仍然是运用化学方法，这对土壤环境和人类健康有着巨大的潜在威胁，生物防治和物理防治相对安全，但是见效慢，因此，选育抗根结线虫的西瓜品种或砧木是安全防治根结线虫的最根本方法。采用常规育种方法选育抗病品种存在育种周期长、效率低等缺点，利用分子技术辅助育种可以大大缩短育种年限，加快育种进程，克隆西瓜抗病基因成为当前利用分子技术辅助育种的工作基础。
　　本试验采用RGA(Resistance gene analogs)策略，即根据已经克隆植物抗病基因产物的保守结构域设计引物，以gDNA和cDNA为模板进行PCR扩增，得到该植物的抗病基因同源序列（Resistance gene analogs，RGA），然后分析RGA与抗病基因的关系，确定候选基因并最终获得新的抗病基因。
　　本试验以西瓜抗根结线虫材料“红籽瓜”和感根结线虫材料“ZDPI0006”及二者杂交后代F1为主要研究对象，利用西瓜基因组数据库，一方面根据已克隆植物抗线虫基因检索西瓜抗线虫基因同源序列，据此设计引物，另一方面根据西瓜基因组数据库公布的NBS基因序列设计引物，共设计了47对引物，用改良CTAB方法提取西瓜叶片基因组DNA，用试剂盒提取西瓜叶片总RNA并反转录为cDNA，以西瓜gDNA和cDNA为模板，通过PCR方法扩增，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测差异条带，最终测序获得了12条序列。经过在GenBank上使用Blast搜索和比对同源序列，结果表明有1条序列为非特异性扩增，共有11个目标片段，分别来自引物W6580F/W6580R、D3F/D3R、N4F/N4R和N23F/N23R的PCR扩增。
　　对这11条序列进行生物信息学分析，结果表明:引物W6580F/W6580R的PCR产物属于西瓜基因Cla006580，它们之间没有长度多态性差异，但有3个SNP位点，其中从感病材料中扩增得到的片段W6580-CP1在LRR结构域内的一个不变残基发生了氨基酸突变，由L突变为F，蛋白质功能预测该片段包含一个Hs1pro-1_C结构域，与甜菜抗线虫基因蛋白有61％的同源性，该基因对于西瓜根结线虫抗性基因的定位与克隆具有重要价值;N4F/N4R的PCR产物属于西瓜基因Cla012424，该基因可能在野生西瓜种质资源中缺失;N23F/N23R属于西瓜基因Cla006813或者Cla006803，与甜瓜R-FOM-2有82％的同源性;D3F/D3R的PCR产物属于西瓜基因Cla019854，与预测的黄瓜TMV抗性蛋白N端类似结构有高达88％的同源性。这5条基因对于西瓜抗性基因的研究具有重要价值，可以进一步研究，开发与抗病基因紧密连锁的分子标记，从而应用于分子选择辅助育种，加速育种进程。

目录

声明

致谢

英文缩略表

摘要

1．文献综述

1．1 根结线虫研究进展

1．1．1 根结线虫的种类

1．1．2 根结线虫的生活史

1．1．3 根结线虫的危害

1．1．4 生产上对根结线虫的防治

1．2 植物抗病基因

1．2．1 植物抗病基因分子机制

1．2．2 抗病基因的保守结构域

1．2．3 已克隆和定位的植物抗线虫R基因

1．3 植物抗病基因同源序列研究进展

1．3．1 同源序列克隆法原理

1．3．2 植物RGA与抗病基因的关系及演化

1．3．3 植物RGA在葫芦科的研究进展

2．引言

3 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌种及质粒

3．1．3 生化试剂

3．2 方法

3．2．1 西瓜总DNA和RNA的提取

3．2．2 提取总DNA和RNA的质量检测

3．2．3 PCR引物的设计与合成

3．2．4 PCR扩增

3．2．5 6％聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

3．2．6 特异条带的回收

3．2．7 大肠杆菌感受态细胞的制备

3．2．8 回收产物的克隆

3．2．9 阳性克隆的PCR鉴定

3．2．10 DNA测序及序列分析

4 结果与分析

4．1 西瓜总DNA和RNA的提取

4．2 目的片段的扩增

4．3 目的片段的回收与克隆及阳性克隆的检测

4．4 目的片段的同源性检索

4．5 目的片段的多重序列比较分析

4．6 利用生物信息学预测目的片段的蛋白质结构

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 西瓜基因Cla006580与西瓜根结线虫抗性基因的相关性

5．2．2 西瓜基因Cla012424的进一步开发利用

5．2．3 西瓜基因Cla006813与枯萎病抗性基因的关系

5．2．4 西瓜基因Cla0019854与TMV抗性基因的关系

5．2．5 抗病基因同源序列的复杂性

5．2．6 RGA法克隆植物抗病基因的局限性

参考文献