玉米转基因和胞质不育检测方法研究

摘要

玉米是重要的粮食作物和饲料作物。分子标记已经广泛应用到了玉米真实性、纯度、转基因和胞质不育检测等方面。随着国家对玉米转基因安全的关注，针对玉米转基因的检测越来越重要。玉米雄性不育制种正在逐步替代常规制种方式，在雄性不育制种时，要解决两个问题，一是雄性不育制种前，要对母本的纯度进行检测;二是雄性不育制种后，要对其杂交种纯度进行检测。以玉米转基因和胞质不育制种的检测需求为背景，基于荧光毛细管平台，建立了玉米转基因和胞质不育多重PCR检测体系.
　　1.前期对zss11b、Bt、PAT、NOS、CaMV356S、NPTII、PMI、HPT、CP4-1，CP4-2这10种外源基因进行了引物设计，经过层层筛选，以玉米zss11b、BT、PAT、NOS和CaMV35S这五个引物成功组成5重PCR。通过在引物下游5'端加G，解决了N+1峰的问题。确定了该体系PCR循环数为35个循环;通过对引物间浓度的调整，提高了多重PCR检测体系的灵敏度，检出限可达到0.1％以下。
　　2.本研究精选表型和遗传基础丰富的29份代表性玉米自交系，其中包括代表不同杂优类群的自交系21份，S型胞质不育（cytoplasmic male sterility，CMS）材料5份，C型CMS材料2份，T型CMS不育材料1份。三套三联体材料京科968、郑单958、先玉335杂交种及其各自双亲。基于叶绿体基因组中11个InDel位点进行引物设计、筛选评估，确定2对玉米S型不育鉴定特异引物。两对引物CPMIDP01CE和CPMIDP02CE的多态分别为83和5个碱基的插入缺失变异，属于trnS-trnG和ndhJ-ndhK基因间区。CPMIDP01CE和CPMIDP02CE引物的扩增产物如果含有83bp插入序列(片段长度为339bp)，不含有5bp的插入序列(片段长度为239bp)，所分析样品即为S型胞质不育材料。两对特异鉴定引物基于变性荧光毛细管、非变性凝胶毛细管、琼脂糖等不同电泳平台均建立了检测方法;并且具有兼容更高效的KASP、TaqMan等技术体系的潜力。本研究基于叶绿体InDel标记建立玉米S型胞质不育制种鉴定的一种简便快捷、稳定高效、低成本、创新性方法，为规模化杂交种生产提供重要的技术保障。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 转基因研究

1．1．1 转基因作物的种植面积

1．1．2 转基因作物的性状

1．1．3 转基因作物的安全管理

1．1．4 转基因成分蛋白检测技术

1．1．5 转基因成分核酸检测技术

1．1．6 多重PCR技术在转基因检测中的应用

1．2 胞质不育鉴定的研究

1．2．1 玉米雄性不育的概述

1．2．2 玉米叶绿体和雄性不育的关系

1．3 本研究目的和意义

2 玉米转基因事件多重检测体系的建立

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 新设计引物的评估

2．3．2 新设计引物多重PCR的建立和国标引物的比较

2．3．3 转基因多重体系的优化

2．4 结论与讨论

3 利用叶绿体InDel标记对玉米S型胞质不育种质鉴定的研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验方法

3．3 结果与分析

3．3．2 玉米S型细胞质不育鉴定特异引物的确定

3．3．3 玉米S型细胞质不育鉴定特异引物特征

3．4 讨论

3．4．2 本研究公布的InDel特异鉴定位点在检测平台的兼容性

3．4．3 正常胞质黄改群(唐四平头群)材料是否对S型胞质雄性不育制种鉴定存在影响

3．4．4 建立S型胞质不育制种快速鉴定方法的优势

参考文献