鉴别玉米细胞质雄性不育材料胞质类型的方法

摘要

本发明公开了一种鉴别玉米细胞质雄性不育(CMS)材料T、C、S胞质类型的方法，其特征在于，利用确定基因型的玉米自交系与待测材料进行常规有性杂交，根据杂交后代雄花育性被恢复或被保持的表型，鉴别待测材料的不育胞质类型，即胞质类型鉴别的雄花育性恢复专效性测定；或利用线粒体DNA的分子杂交，根据限制性片段长度的多型性(RFLP)指纹图谱，鉴别待测材料的不育胞质类型；或利用设计的引物，对线粒体DNA进行聚合酶链式反应(PCR)反应，根据PCR指纹图谱，鉴别待测材料的不育胞质类型。

说明书

                                 技术领域

本发明属于植物育种技术领域，具体涉及鉴别玉米细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)材料胞质的方法，专门用于玉米CMS育种者和玉米杂交种不育化制种生产者对胞质类型(正常胞质(N)和T，C，S型不育胞质)的田间鉴定与实验室鉴定。

                                 背景技术

玉米细胞质雄性不育材料最早由Rhoades.M.M于1931年发现。至今，世界上已发现一百多种不同胞质来源的CMS材料，玉米是世界上最早利用CMS种质生产杂交种的重要粮食作物。利用CMS遗传种质配制杂交种，不仅能保证杂交种种子的质量，而且能减少劳力投入、降低生产成本、减轻劳动强度，从而获得巨大的经济效益。因此一直受到各国育种家和种子生产者的关注，到1970年，利用选自Texas”墨西哥六月”的玉米不育系生产的CMS杂交种已占全美国玉米生产面积的85％。然而CMS杂交种在生产上的巨大增益，使人们完全忽视了1961年在菲律宾发现专化性侵染Texas”墨西哥六月”不育胞质的玉米小斑病T型生理小种的报道。从而导致这一病原小种在美国大面积的玉米不育胞质寄主群体中疯狂地蔓延，造成全美1970年玉米生产严重减产，损失高达30亿美圆。惨痛的历史教训使科学家意识到寻找新型的细胞质不育种质，避免单一细胞质不育材料的广泛使用是有效利用作物CMS的重要前提。CMS胞质的鉴定与分类是实现这一前提的重要保证。1971年Beckett J.B.(Crop Science，1971，11，p724)率先选用18个玉米测验种，对30种不同胞质来源的CMS材料进行广泛的测交和杂交后代的育性鉴定，根据育性恢，保关系的归纳分析，将玉米CMS的胞质类型分类为T，C，S三种，并证明S型不育胞质是玉米CMS种质中的最大一类。华中农业大学玉米组从20世纪70年代以来，先后育成S组胞质的华玉2号、华玉3号和华玉4号雄性不育杂交种。中国农业大学，河南农业大学先后育成C型细胞质雄性不育的杂交种，均收到了良好的经济效益，近年来仍有扩大发展的趋势。

由于玉米T，C，S三种胞质类型的CMS，各自具有不同的遗传规律和表型效应。育种者在组配三系杂交组合时，需首先明了所利用的CMS材料的胞质类型；研究者对新发现的玉米CMS材料需研究其不育胞质类型的归属；杂交种生产者在收获，加工及包装时需对CMS种子的胞质质量进行严格的检测。而Beckett J.B所采用的18个测验种的庞大测交鉴定体系几乎无法在研究和生产中使用。他所使用的测验种在我国也难以寻觅。

                                 发明内容

本发明的目的旨在建立一种准确，快速的鉴定玉米CMS胞质类型的方法，它既可对新发现的CMS材料进行胞质归类鉴定，又可用于对制种田间的植株样本和收获后的种子样本进行质量检测，同时本发明中包括了CMS胞质的DNA指纹图谱技术，因此也可为解决种子质量纠纷提供具有法律效益的司法证据。

本发明通过以下技术方案实现：

1、一种鉴别玉米细胞质雄性不育(CMS)材料T、C、S胞质类型的方法，其特征在于，利用确定基因型的玉米自交系与待测材料进行常规有性杂交，根据杂交后代雄花育性被恢复或被保持的表型，鉴别待测材料的不育胞质类型(简称胞质类型鉴别的雄花育性恢复专效性测定)；或利用线粒体DNA的分子杂交，根据限制性片段长度的多型性(RFLP)指纹图谱，鉴别待测材料的不育胞质类型(简称胞质类型鉴别的线粒体DNA的RFLP指纹图谱技术)；或利用设计的引物，对线粒体DNA进行聚合酶链式反应(PCR)反应，根据PCR指纹图谱，鉴别待测材料的不育胞质类型(简称胞质类型鉴别的线粒体DNA的PCR指纹图谱技术)。

2、所述的胞质类型鉴别的雄花育性恢复专效性测定按照下列步骤；

1)以确定基因型的自交系恢313、自凤1作为玉米CMS材料胞质类型鉴别的测验种；

2)将待测材料分别与恢313、自凤1自交系杂交，配制杂交种，按常规大田方式种植；

3)开花期对测交后代按雄花完全不育、高度不育、半可育、高度可育和完全可育5级育性表型进行育性鉴定，确定不育性被保持或被恢复的表型；

4)根据育性的表型鉴别玉米CMS的不育胞质类型。

3、所述的胞质类型鉴别的线粒体DNA的RFLP指纹图谱按照下列步骤；

1)将待测材料在30℃黑暗条件下播种，出苗后暗培养7天；

2)提取黄化苗总DNA；

3)用BamHI或HindIII限制性核酸内切酶酶切总DNA；

4)分别从线粒体DNA克隆B376和pH2-7-1中，分离5.6kb的cob克隆片段和1.7kb的coxII克隆片段，制备探针；

5)按cob/BamH I或coxII/HindIII的探针/酶组合进行Southern杂交

6)根据RFLP指纹图谱鉴别玉米CMS不育胞质类型。

在cob/HindIII探针/酶组合的Southern杂交图谱中(图2)

N、T、C材料的实验结果完全一样，杂交带为6.4kb和1.8kb

S胞质具有4.4kb和1.8kb的杂交带纹，

凡具有4.4kb带纹的CMS胞质被确定为S胞质。

在coxII/BamH I探针/酶组合的Southern杂交图谱中(图1)

T胞质材料具有2.5kb的特定杂交带纹

凡具有2.5kb带纹的CMS胞质被确定为T胞质

C胞质材料具有5.0kb的特定杂交带纹

凡具有5.0kb带纹的CMS胞质被确定为C胞质

S胞质材料具有2.0kb的特定杂交带纹

凡具有2.0kb带纹的CMS胞质被确定为S胞质

N胞质材料具有6.0kb的特定杂交带纹，

凡具有6.0kb带纹的胞质被确定为(N)正常胞质

4、所述的胞质类型鉴别的线粒体DNA的PCR指纹图谱按照下列步骤；

1)取待测材料籽粒或叶片，用小样法提取总DNA；

2)加入鉴别玉米T、C、S材料不育胞质的特异引物；

3)进行一次聚合酶链式反应(PCR)，扩增，电泳；

4)根据PCR指纹图谱鉴别玉米CMS不育胞质类型。.

5、所述的引物如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示。

以下对CMS材料胞质类型鉴别的线粒体DNA的PCR测定方法作进一步地描述：

(1)取待测材料籽粒或叶片，用小样法提取总DNA

(2)加入本发明设计的玉米T、C、S材料胞质不育相关基因的三对(如序列表SEQ ID NO：1-6所示)特异引物

以下是根据GENEBANK的登记序列Z11843所设计的引物：

设计引物C-1 5′-TGAAAGGGTGGTGGAATA-3(序列表中的编号为SEQ ID NO：1)

引物C-2 5′-GAGCCAAAGTAATGAGAAAA-3(序列表中的编号为SEQ ID NO：2)

扩增的目标片断为Z11843的第176Nt至第854Nt共698个碱基。

以下是根据GENEBANK的登记序列AF542203设计的引物：

设计引物S-1 5′-GATGCTATGCTAAGCGAGAT-3′((序列表中的编号为SEQ ID NO：3))

引物S-2 5′-CCGCTAACCCACTCTTCT-3′(序列表中的编号为SEQ ID NO：4)扩增的目标片断为AF542203的第3766Nt至第4633Nt共885个碱基。以下是根据GENEBANK的登记序列M12582设计的引物：

设计引物T-1  5′-GTCGTGTCCTGGTAGCCT-3′(序列表中的编号为SEQ ID NO：5)

引物T-2  5-CCTCCTTCATTCCGTTGT-3序列表中的编号为(SEQ ID NO：6)扩增的目标片断为M12582的第1052Nt至第1469Nt共435个碱基。

(3)进行一次多聚酶链式反应(PCR)，扩增，电泳

PCR扩增的程序为：

94℃/1min(变性)---55℃/1min(退火)---72℃/1min(延伸)，30次循环，

扩增产物在Agarose凝胶(溴化乙锭染色)上，90V电泳1小时30分钟。

(4)根据PCR指纹图谱(如图3所示)鉴别玉米CMS不育胞质类型。

电泳图谱显示PCR扩增产物为689个碱基带纹的试材，被确定为C胞质

电泳图谱显示PCR扩增产物为885个碱基带纹的试材，被确定为S胞质

电泳图谱显示PCR扩增产物为435个碱基带纹的试材，被确定为T胞质

电泳图谱显示没有PCR扩增产物的试材，被确定为正常(N)胞质

使用者可根据各单位的具体条件和目的选用本发明中的某一项鉴定方法开展工作；胞质类型鉴别的雄花育性恢复专效性测定方法；

本发明的方法经济有效，不需特殊的仪器设备，但需经过两个生长季节才能得出可靠的结论，适于育种者使用。

本发明的胞质类型鉴别的线粒体DNA的RFLP指纹图谱方法需要特殊的从事分子生物学研究的仪器设备，约15天可以获得胞质分类结果，适于应用基础研究者使用。

本发明的胞质类型鉴别的线粒体DNA的PCR指纹图谱方法简便实用，它不仅只需少许的玉米叶片或单粒玉米，而且在6小时内就可得到准确可靠的鉴定结果。因而更适于种子生产者和管理部门对田间大样本和种籽大样本进行质量检测。

本发明的线粒体DNA的RFLP指纹图谱和PCR指纹图谱的生物技术，具有不受环境条件影响，不受生长季节限制，带型特征稳定的优点，因此也适用于为种子质量纠纷需要调处，接受有关司法鉴定机构的委托的测试分析任务。

附图及其说明

图1：玉米CMS线粒体DNA coxII/BamHI探针/酶组合RFLP的指纹图谱；

图中M表示分子量标记，数字1-18表示表1中的材料样本序号，N，T，C，S分别表示胞质类型

图2：玉米CMS线粒体DNA cob/HindIII探针/酶组合RFLP的指纹图谱；

图中M表示分子量标记，数字1-18表示表1中的材料样本序号，N，T，C，S分别表示胞质类型

图3：玉米CMS线粒体DNA PCR的指纹图谱；

图中M表示分子量标记，数字1-10表示表3中的材料样本序号，N，T，C，S分别表示胞质类型

                                 具体实施方式

实施例1：玉米77CMS-X胞质类别的鉴定

1、供试材料

本试验共采用18种两套同核异质和同质异核材料，由本申请人华中农业大学玉米室提供。每种材料分别与玉米自交系恢313、自凤1杂交，根据F1育性进行胞质分类。

               表1        供试材料

序号    材料名称       序号    材料名称

1       Mo17            10     77CMS-T

2       Mo17CMS-T       11     77CMS-EL

3       Mo17CMS-RB      12     77CMS-C

4       Mo17CMS-EL      13     77CMS-唐徐

5       Mo17CMS-唐徐    14     77CMS-Vg

6       Mo17CMS-C       15     77CMS-X(未知胞质)

7       Mo17CMS-双      16     77CMS-江

8       Mo17CMS-J       17     77CMS-S

9       77              18     77CMS-R金

2、实验方法

2.1育性恢复专效性鉴定

18种供试材料分别与带有特定基因型的玉米自交系恢313、自凤1杂交，配制杂交种；按常规大田方式种植；开花期按雄花育性5级鉴定标准进行育性鉴定。

          表2    玉米雄花育性表型的分级标准

            表2   玉米雄花育性表型的分级标准

1    完全不育     花药干瘪，不露出颖壳，无花粉或花粉败育

2    高度不育     极少数花药露出颖客，无花粉或花粉败育

3    半可育       花药半饱满，多数花药外露，部分散粉

4    高度可育     花药饱满，花粉正常，大部分花药外露并散粉

5    完全可育     正常开花，大量散粉

2.2玉米黄化苗总DNA提取和纯化：

所有试材的黄化苗DNA提取采用CTAB法(如下所述)

①取玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中，按每克样本加入2ml预热至65℃的CTAB提取液(1.17MNaCL、0.1016M EDTA-8.0，0.835M Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)，混匀，65℃水浴60-90分钟，每15min摇匀一次。

②水浴结束后，冷却至室温(25℃)，加入等体积氯仿：异醇(24∶1)，小心摇动试管10分钟，使下层有机相由无色→绿色→黑色(深绿色)。

③室温下(≥20℃)，3.2Krpm离心10分钟，用剪去头部的5ml吸头将上清转移另一离心管中，若上清仍为绿色则用24∶1再提一次。

④加入2/3体积异丙醇，轻柔颠倒两下，静置20min后轻柔地充分混匀，使DNA成团。用钩子挑出DNA，用70％乙醇于1.5ml离心管中浸洗24小时，中途换一次洗液。

⑤DNA纯化：将DNA吹干，加入适量TE-8.0缓冲液，置于65℃水浴中15分钟，以溶解DNA；冷至室温后，加入10μl 10mg/ml RNaseA，混匀；在37℃下，温育2小时，再用等体积苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，室温下，8Krpm离心10分钟，在上清液中加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)，加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA；钩出絮状DNA，放入1.5ml Eppendorf试管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去乙醇，吹干DNA沉淀。每管加入适量T.E-8.0缓冲液，充分溶解DNA沉淀，存在-20℃冰箱中备用。

2.3限制性片段长度的多型性(RFLP)分析

①用适量的TE缓冲液溶解叶片总DNA，在260nm和280nm的波长下测定吸光值，确定DNA浓度，并用0.8％的琼脂糖电泳检查DNA提取的质量，主带清晰的样品可用于下一步的实验。

②取10μg左右的总DNA于1.5μl的Eppendorf试管中，加入30单位的限制性内切酶，5μl10×缓冲液，2μlBSA，加入ddH₂O使终体积至50μl，混匀后在37℃下酶切16-20hrs。酶切后的样品取4μl在0.8％的琼脂糖上电泳检测，100V电泳1.5hrs，DNA呈弥散状表明DNA酶解反应完全。确认酶切效果后，制备0.8％的琼脂糖凝胶，每50μlDNA酶切反应液加入5μl点样缓冲终止酶切反应，每一泳道点入全部(55μl)的DNA酶切样本液，完成电泳过程。

③将凝胶切割成适宜的大小，用0.2mol/L HCl液变性8分钟直至胶块变黄，迅速地用0.4mol/L NaOH溶液作为转移液，通过毛细管原理将胶上的DNA转移至N′-尼龙膜上，24小时后将尼龙膜用2×SSC液漂洗2次，每次5分钟，晾干后用滤纸夹好，80℃-120℃真空烘箱中烘烤2-3小时，使DNA固定在膜上。

④探针的标记

每张杂交膜使用探针液25μl

ddH₂O                           7.7μl

探针DNA(100ng/μl)                2.0μl

λ/HindIII(1ng/μl)               0.8μl

随机引物+缓冲液                   7.5μl

dNTP(-dCTP)(2mM)                  3.0μl

Klenow酶(2unit/μl)               2.0μl

α³²P-dCTP                       20μci

总体积：                          25μl

混匀后，37℃保温4-8小时，再加入等体积TE缓冲液，10倍体积的探针预杂交液250μl(0.05Mtris-8.0，0.01M EDTA-8.0，5XSSC，1倍denhardts，0.2％SDS)，100℃水浴10min，再冰浴10min备用。

⑤分子杂交和放射自显影

转移后的尼龙膜在预杂交液中，65℃下进行4~6小时的预杂交后，到掉预杂交液，加入标记好的探针，根据膜的数量(按每张膜5~10ml杂交液)加入预热至65℃的杂交液(10％Dextran Sulfate，0.05Mtris-8.0，0.01M EDTA-8.0，5×SSC，1×denhardts，0.2％SDS)，于65℃缓慢转动杂交16~20小时左右。

弃去杂交液，加入2×SSC，0.5％SDS低严谨度的洗膜缓冲液于室温下洗膜2次，每次20分钟，以0.2××SSC，0.1％SDS高严谨的洗膜缓冲液，于65℃洗膜2次，每次30min。取出膜用吸水纸吸干膜表面浮水，保鲜膜包好杂交膜，检测膜上放射性强度，记录数据，打开暗匣依次放好增感前屏，X光片，杂交膜，增感屏后屏。关好暗匣存于-70℃冰箱中，根据放射性强度大小，自显影10~15天。

杂交膜去探针重复使用：0.1×SSC，0.1％SDS，90℃~95℃条件下洗膜30min，确定探针洗脱后，重复杂交使用。

3、实验结果

3.1育性恢复专效性鉴定结果：

按照育性恢复专效性分类的方法，凡被恢313恢复的(测交后代的育性为高度可育或完全可育)，待测材料被确定为具有S型胞质、凡被恢313保持(测交后代的育性为完全不育或高度不育)，同时被自凤1恢复的，待测材料被确定为具有C型胞质、凡被恢313保持，同时又被自凤1保持的，待测材料被确定为具有T型胞质。

除77为正常可育胞质外，在其他17种CMS材料中，被鉴定为

T胞质的有：Mo17CMS-T、77CMS-T；

C胞质的有：Mo17CMS-C、Mo17CMS-RB、Mo17CMS-EL、77CMS-EL、77CMS-C；

S胞质的有：Mo17CMS-唐徐、Mo17-双、Mo17CMS-J、77CMS-唐徐、77CMS-Vg

77CMS-江、77CMS-R金、77CMS-S。

未知胞质77CMS-X被鉴定为C胞质。

3.2 RFLP技术测定结果

3.21 cob/HindIII的探针/酶组合

供试材料在cob/HindIII的探针/酶组合中的RFLP结果如图2。

结果表明：15号材料未知胞质77CMS-X被鉴定为不属于S胞质。供试材料在cox II/BamH I的探针/酶组合中的RFLP结果如图1：结果表明：15号材料未知胞质77CMS-X被鉴定为C胞质。

实施例2：玉米胞质的PCR指纹鉴定

1、供试材料

    表3  玉米胞质的PCR指纹鉴定供试材料

序号    材料名称     序号    材料名称

1       Mo17CMS-C    6       Mo17CMS-S

2       77CMS-C      7       Mo17CMS-双

3       Mo17CMS-EL   8       77CMS-T

4       Mo17         9       Mo17CMS-T

5       77CMS-S      10      W23-T

2、实验方法：

2.1 DNA提取使用”小样本总DNA提取方法

①取100mg样于1.5ml离心管中，加入500μlCTAB提取液(1M tris-8.0 100mM；0.5MEDTA-8.0 150mM；5M NaCl 2100mM；PVP 2％；CTAB 2％；14M βME 140mM)，

用自制与离心管相配的玻璃钻头，电钻碾磨一分钟；

②将磨好的样品置于65℃水浴20min；水浴过程中，间隔5-10min轻轻混匀样品一次；

③向经过水浴处理的样品中加入600μl 24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，轻轻混匀3min

④将混匀好的样品于台式离心机中12000rpm离心8分钟；

⑤将上清液转入另一新的1.5ml离心管中，加入400μl-20℃预冷的无水乙醇，10000rpm离心3分钟；

⑥倒掉上清液，用75％的乙醇清洗DNA沉淀物一次，小心吸干乙醇，室温下晾干DNA沉淀物；

⑦加500μl灭过菌的双蒸水溶解DNA沉淀。取5μl用于PCR反应。

2.2聚合酶链式反应(PCR)反应体系：

DNA样品液                5ul

10×缓冲液(Mg²⁺)        2ul

dNTPs(2mM)               2ul

Taq酶(5u/ul)             0.2ul

引物(50uM)               0.2ul

ddH₂O                  10.6ul

Tatal V                  20ul

注：将C1、C2、S1、S2、T1、T2六种引物各0.2ul加入反应体系中

2.3聚合酶链式反应(PCR)程序：

步骤1  94℃/3分钟

步骤2  {94℃/1分钟；55℃/1分钟；72℃/1分钟}30个循环

步骤3  72℃/5分钟，1个循环

步骤4  4℃，保存

3、实验结果：

3、实验结果：

实验结果如图3所示；

序号为1-3号测试材料(Mo17CMS-C，77CMS-C，Mo17CMS-EL)扩增带大小为698bp被鉴定为C胞质；

序号为4号测试材料(Mo17)无带纹，被鉴定为正常(N)胞质；

序号为5-7号测试材料(77CMS-S，Mo17CMS-S，Mo17CMS-双)扩增带大小为885bp被鉴定为S胞质；

序号为8-10号测试材料(77CMS-T，Mo17CMS-T，W23-T)扩增带大小为435bp被鉴定为T胞质。

实施例3；本发明用于种子质量纠纷的司法委托鉴定与测试

2000年本发明人接受某司法鉴定机构的委托对某一玉米杂交组合的正常胞质和不育胞质两种杂交种的胞质类型进行鉴定，本发明人采用本发明的RFLP指纹技术对样品进行了检测分析(所述的测试步骤如本发明的说明书所述)。测试与分析结果表明：  样本中部分标签的被测试品种有正常可育胞质杂交种的样本确证为S型不育胞质杂交种，而部分标签的被测试品种有不育胞质杂交种的样本确证为正常可育胞质(N)杂交种。本发明人的分析检测报告为司法部门正确裁决这起种子质量纠纷提供了具有法律效力的科学依据。

                     SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>鉴别玉米细胞质雄性不育材料胞质类型的方法

<130>

<141>2003-03-10

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>1

tga aag ggt ggt gga ata                                      18

    Lys Gly Gly Gly Ile

    1               5

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(20)

<223>

<400>2

gag cca aag taa tga gaa aa                                   20

Glu Pro Lys         Glu

1

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(20)

<223>

<400>3

gat gct atg cta agc gag at                                    20

Asp Ala Met Leu Ser Glu

1               5

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>4

ccg cta acc cac tct tct                                    18

Pro Leu Thr His Ser Ser

1               5

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>5

gtc gtg tcc tgg tag cct                                    18

Val Val Ser Trp     Pro

1                   5

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>玉米(maize)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>6

cct cct tca ttc cgt tgt                         18

Pro Pro Ser Phe Arg Cys

1               5