磺胺喹恶啉单克隆抗体的制备及酶联免疫快速检测方法的建立

摘要

磺胺喹恶啉(Sulfaquinoxaline，SQ)是一种高效抗球虫剂和抗菌剂，主要用于治疗家禽、反刍幼畜及小动物的球虫病。养殖场为防治和治疗动物疾病常在动物饲料或饮用水中加入磺胺喹恶啉，常导致畜禽急慢性中毒和畜禽制品的药物残留，人经常低剂量摄入含有磺胺喹恶啉残留的动物源性食品，当它在体内富集达一定浓度时，可造成变态反应、过敏反应，甚至致畸、致癌作用。因此各国都比较重视其残留的检测问题，中国及欧盟、日本、美国等西方发达国家规定磺胺喹恶啉残留限量为100ng/g。目前，在药残检测领域，免疫学分析方法因其操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、成本低、可实现批量检测的优势已成为国内外研究热点。本研究旨在建立磺胺喹恶啉残留的酶联免疫检测(ELISA)方法，以方便养殖户自检，并为有效监管磺胺喹恶啉的使用及残留情况提供更好的研究依据。
　　 本研究依据磺胺喹恶啉与载体蛋白(BSA、OVA)的分子结构，采用重氮化法合成免疫原原BSA-SQ，进而制备单克隆抗体，最终成功研制出磺胺喹恶啉直接竞争ELISA快速检测试剂盒。主要研究成果如下：
　　 1.磺胺喹恶啉完全抗原的制备及鉴定
　　 分别用戊二醛(GA)法、碳二亚胺(EDC)法、重氮化法探索人工抗原BSA-SQ的制备，并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE电泳对其进行初步鉴定。结果表明：采用GA法与EDC法制得的BSA-SQ偶联效果不理想，用重氮化法制备BSA-SQ效果较好。将重氮化法制备的人工抗原BSA-SQ免疫BALB/C小鼠，获得了高价、敏感的抗磺胺喹恶啉多克隆抗体(pAb)，确定重氮化法制备人工抗原BSA-SQ获得成功。
　　 2.磺胺喹恶啉单克隆抗体的制备及免疫学特性的鉴定
　　 经BSA-SQ免疫产生多抗的BABL/C小鼠，用酶联免疫吸附试验(ELISA)实验筛选出细胞融合备用小鼠1只；超免后，将其脾细胞与NS0瘤细胞用PEG4000进行细胞融合，HAT培养液筛选培养；有限稀释法进行3次克隆化，获得了3株产磺胺喹恶啉单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株1H8-B11、1H8-C6、1H8-F5；采用体内诱生腹水法大量生产后纯化。经鉴定，1H8-B11、1H8-C6、1H8-F5细胞培养上清间接ELISA效价分别为1:1.92×102、1:1.92×102、1:3.84×102，腹水效价分别为1:2.0×105、1:2.0×105、1:2.56×105，亲和力测定表明细胞株1H8-F5亲和常数(Ka)最高，为4.19×109 L/moL，阻断ELISA测定其SQ IC50为13.1ng/mL，与磺胺氯吡嗪钠的交叉反应率(CR)为20[％]，与其他同类化合物无CR。
　　 3.磺胺喹恶啉的酶联免疫快速检测方法的建立
　　 在制得SQ mAb的基础上，依据直接竞争ELISA实验原理，组装制备了SQ残留快速检测直接竞争ELISA试剂盒(SQ-Kit)。SQ-Kit标准曲线回归方程为y＝-0.262x＋0.6778，相关系数R2＝0.9786，SQ IC50为7.5ng/mL，检测下限为5.0ng/mL。线性检测范围为5.0～128.0ng/mL，并具有良好的特异性、重复性和稳定性。该SQ-Kit用于检测牛奶和肉样中磺胺喹恶啉残留的工作可以在1.5～2h内完成，具有快速、简便、敏感、特异等特点，适合于SQ残留快速检测的大规模定性、定量鉴定。