姜黄素对顺铂耐药肺癌细胞EMT抑制作用及机制探讨

摘要

背景：
　　近些年来，肺癌的发病率越来越高，而且呈年轻化趋势，对我国居民的身心健康造成严重威胁。化疗是肺癌治疗的主要方式之一，但是化疗过程中肿瘤细胞容易产生多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)，而MDR细胞易发生上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。
　　EMT的发生会促进肺癌侵袭、转移，严重影响病人的预后和生存期，在上皮细胞转变成间质细胞的过程中，细胞的形态特征发生变化、获得了间质细胞的分子标记物，具有更强的侵袭和迁移能力。EMT是受多种转录因子调控的，Wnt/β-catenin-Snail信号通路是重要的调控通路之一，Wnt/β-catenin广范分布于真核细胞中，具有多种调节功能，可被多种细胞因子或化疗药物激活，与肿瘤细胞的MDR密切相关。
　　近年来，研究者致力于肿瘤耐药逆转剂的开发研究，期望针对耐药性和恶性程度更高的肺癌病例能寻找到更有效的治疗方案。姜黄素是一种植物多酚，能够通过不同机制促进肿瘤细胞凋亡、抑制多种肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞扩散和逆转肿瘤细胞的耐药性。已有学者证实，姜黄素可以通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，进而下调Wnt/β-catenin下游的重要转录因子Snai的表达，达到抑制癌细胞EMT的作用。
　　因为耐药细胞容易发生EMT，而EMT与肿瘤细胞的转移及浸润密切相关，我们提出假设：姜黄素可能通过Wnt/β-catenin-Snail信号通路抑制EMT来发挥抗耐药肺癌侵袭的作用。
　　目的：
　　本研究主要以耐顺铂肺癌细胞为主要研究对象，通过体外实验观察姜黄素对耐顺铂肺癌细胞EMT的抑制及探讨初步的机制，为耐药肺癌的治疗提供理论依据。
　　方法：
　　1.采用中等浓度间歇作用法建立肺癌顺铂耐药细胞，命名为A-549/CDDP，MTT法测定细胞的耐药指数及交叉耐药性，以不同浓度的姜黄素处理A-549/CDDP细胞48h，检测其对耐药细胞增殖的抑制。
　　2.细胞骨架染色、Transwell细胞迁移侵袭实验来检测姜黄素对A-549/CDDP细胞形态变化、迁移和侵袭能力的影响。
　　3.荧光定量PCR和Western blot分别检测在姜黄素处理前后A-549/CDDP细胞中EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)，间质细胞的分子标记N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白（Fibronectin）在mRNA和蛋白水平表达变化。
　　4.荧光定量PCR检测在姜黄素处理前后A-549/CDDP细胞中基因β-catenin、Axin2、C-myc、Wntless、Slug，Snail，ZEB1，Twist1在mRNA水平的表达变化。
　　5.Western Blot检测抑制剂Dkk1(20μmol/L)刺激A-549/CDDP细胞后，姜黄素对E-cadherin、N-cadherin、vimentin以及β-catenin、Wntless、Snail表达的影响。
　　结果：
　　1.成功建立了肺癌顺铂耐药细胞A-549/CDDP，耐药指数为54.46，对阿霉素、5-氟脲嘧啶、紫杉醇产生交叉耐药性，姜黄素对A-549/CDDP细胞的增殖有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖性。
　　2.Transwell迁移侵袭实验中，在30μmol/L浓度的姜黄素作用下，A-549/CDDP组细胞的迁移和侵袭明显慢于对照组，差异有统计学意义。
　　3.细胞骨架染色观察姜黄素对A-549/CDDP细胞形态的影响，罗丹明细胞骨架蛋白染色显示，A-549/CDDP细胞与A-549亲本细胞相比，细胞发生上皮间质化，细胞形态不规则，呈纺锤样及成纤维细胞样细胞表型。在姜黄素作用下，细胞膜肌动蛋白凝集，细胞收缩。
　　4.与A-549细胞相比，耐药细胞的E-cadherin在mRNA及蛋白水平的表达明显下调，而N-cadherin及Vimentin在mRNA及蛋白的水平的表达明显上调，姜黄素作用于耐药细胞后逆转了这一现象，提示姜黄素可通过改变细胞内EMT相关分子表达抑制A-549/CDDP细胞EMT的发生。
　　5.荧光定量PCR、Western blot检测提示，肺癌细胞发生耐药及EMT后，细胞内Wntless、β-catenin及Snail的表达增强，姜黄素可以阻断这一作用，提示姜黄素可能通过Wnt/β-catenin-Snail通路影响EMT作用。
　　结论：：
　　1.姜黄素能够抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖，这种抑制作用呈剂量依赖性。
　　2.姜黄素能够逆转顺铂耐药肺癌细胞的EMT现象，这种逆转是通过改变细胞内EMT相关的蛋白表达实现的。
　　3.姜黄素逆转顺铂耐药肺癌细胞的EMT作用，其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin-Snail信号通路实现的。

目录

缩略词表

1引 言

2 材料与方法

2.1 实验研究用的细胞

2.2.实验仪器和材料

2.3实验方法

2.4统计学处理

3 结 果

3.1 MTT检测A-549/CDDP细胞药物敏感性及姜黄素对其增殖的抑制

3.2 MTT实验检测姜黄素对A-549/CDDP细胞增殖的抑制

3.3姜黄素抑制A-549/CDDP 细胞的迁移侵袭

3.4细胞骨架染色观察姜黄素对A-549/CDDP细胞形态的影响

3.5荧光定量PCR检测姜黄素对A-549/CDDP 细胞EMT标志物在mRNA水平表达的影响

3.6 Western blot检测姜黄素对A-549/CDDP 细胞EMT标志物在蛋白水平表达的影响

3.6荧光定量PCR检测在姜黄素处理前后A-549/CDDP细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关因子在mRNA水平的表达变化

3.7姜黄素通过抑制Wnt/β-catenin通路逆转EMT

4 讨论

5结 论

参考文献

综述:肺癌细胞EMT的研究进展

参考文献

致谢