未知RNA病毒性病原体序列非依赖性单引物扩增技术的建立及应用

摘要

目的：建立一种未知病毒性病原体的检测方法-序列非依赖的单引物扩增（sequence independent single primer amplification，SISPA）技术，为传染病疫情尤其是新发传染病的预防控制、临床诊断及治疗提供科学依据。
　　方法：
　　1、以发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（ Severe Fever with Thrombocytopenic Syndrome Bunyavirus，SFTSV）毒株为研究对象，对样品进行过滤及DNase I消化处理，并对处理后的SFTSV毒株提取总RNA。
　　2、使用含有已知片段的随机引物对提取的RNA进行逆转录，合成双链cDNA，并对其进行纯化。
　　3、将随机引物中的已知片段作为单引物，非特异性扩增(SISPA-PCR)病原体基因。
　　4、对SISPA-PCR扩增产物进行分析及纯化回收、TA克隆。
　　5、鉴定克隆结果，选出含有插入片段的重组质粒进行测序，应用BLAST软件比对分析该核酸的同源性，判断其所属物种。
　　6、将SFTSV毒株提取的核酸进行10倍连续梯度稀释，并以稀释样品为研究对象，对建立的SISPA方法进行灵敏度分析。
　　7、以本实验室提供的肠道病毒毒株CoxA16和EV71、甲型流感病毒毒株H1N1及该几种病毒的混合液为研究对象，对建立的SISPA方法进行特异度分析。
　　8、SISPA方法的应用，应用SISPA方法检测河北省平山县采集的76份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本。
　　结果：1 SISPA方法的初步建立：SISPA扩增SFTSV毒株中的RNA，可以得到多个DNA片段，然后将所有PCR产物回收纯化、克隆、测序，经 BLAST软件分析，与 GenBank中的 SFTSV基因序列同源性最高达98％，可判断所检测的病原体为SFTSV；2灵敏度分析：稀释后的SFTSV核酸浓度区间为106-101TCID50/ml。稀释样品经SISPA-PCR扩增，电泳显示浓度为106-102TCID50/ml的样品呈现出典型的SISPA扩增条带，且在不同时间进行的至少3次实验结果一致，由此可见，该方法对病毒 SFTSV的检测下限可达到102 TCID50/ml，灵敏度较高，可检测低浓度的病毒核酸；3特异度分析：将CoxA16、EV71及HIN1毒株及该几种病毒的混合液分别经SISPA-PCR扩增，分别获得多个DNA片段，经TA克隆、测序及序列分析，与GeneBank中的CoxA16、EV71及H1N1基因序列同源性分别高达98%、97%、99%，可判断检测的病原体分别为CoxA16、EV71及H1N1，且在不同时间进行的至少3次实验结果一致，由此说明该方法可在一个反应体系中特异地将多种病毒检测出来，特异度较好；4 SISPA方法的应用：SISPA-PCR方法检测河北省平山县采集的76份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本，其中有11份检测为Echo18阳性。
　　结论：
　　1、成功建立了应用序列非依赖的单引物扩增（SISPA）技术检测未知RNA病毒性病原体的技术平台。
　　2、建立的 SISPA方法不依赖病毒分离培养，缩短了检测未知病毒的时间，可快捷地鉴定病毒性病原体。
　　3、建立的SISPA方法的检测下限是102TCID50/ml，可用于检测低浓度的未知序列的病毒核酸。
　　4、SISPA方法既适用于检测已知病毒，也适用于检测未知病毒，适用范围较广。

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前言

材料与方法

1 材料

1.1 标本来源

1.2 引物合成

1.3 研究中所用主要试剂

1.4 培养基的配制

1.5 研究中所用主要仪器

2 实验方法

2.1 以SFTSV毒株为研究对象，建立SISPA方法

2.2 SISPA方法的灵敏度分析

2.3 SISPA方法的特异度分析

2.4 SISPA方法的应用

结果

1 SISPA方法的初步建立

1.1 SISPA方法扩增SFTSV样品中的核酸

1.2 PCR产物TA克隆、酶切鉴定

1.3 测序结果

1.4 序列分析

2 SISPA方法的灵敏度分析

3 SISPA方法的特异度分析

3.1 DNase I-SISPA-PCR分别扩增肠道病毒CoxA16、EV71、甲型流感病毒H1N1及上述病毒混合物中的病原体RNA

3.2 PCR产物TA克隆、酶切鉴定

3.3 测序结果

3.4 序列分析

4 SISPA方法的应用

4.1 DNase I-SISPA-PCR方法扩增脑脊液中微量病原体RNA

4.2 PCR产物TA克隆、酶切鉴定

4.3 测序结果

4.4 序列分析

附图

讨论

结论

参考文献

综述: 新发感染病的流行趋势及其鉴定的分子生物学技术

致谢

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