发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂提取与初步分离研究

摘要

目前，世界人口老龄化趋势日益严重，阿尔茨海默症(AD)的发病率也在逐年上升，如何预防和治疗阿尔茨海默症，受到了人们越来越多的关注。近年来，一些研究显示某些特殊食物及药用植物中的活性成分有助于降低阿尔茨海默症的发生风险，因此，开发具有预防和治疗AD的功能性食品具有重要意义。本研究在自制纯种发酵大豆中发现具有较强的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性成分，通过比较不同原料、不同发酵时间的发酵大豆，筛选出最适发酵原料及发酵时间;并采用超声波辅助提取法对发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取工艺进行了优化;通过对乙醇提取物进行分级萃取，确定了有效极性部位;采用大孔吸附树脂对萃取组分进行了初步分离及富集，以期为开发预防和降低AD发病风险方面的药食同源发酵大豆食品提供相应理论基础和试验依据。主要研究内容和结果如下:
　　 1.对比考察了不同原料（黄豆、脱脂豆粕、黑豆、去皮黑豆原料）及其在浸泡和发酵不同时间(0h、24h、48h、72h、96h、120h)下的发酵样品，通过测定比较乙酰胆碱酯酶IC50值，发现大豆原料几乎不具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性，而发酵后抑制作用显著增强，其中去皮黑豆发酵96h的样品抑制效果最好，IC50值可达到0.045mg/mL。
　　 2.通过单因素试验和三因素三水平响应面试验，研究了乙醇浓度、料液比、超声功率、超声时间和超声温度对乙酰胆碱酯酶抑制剂提取液IC50值的影响;建立了乙醇浓度、料液比和超声时间对IC50值的回归数学模型:IC50=0.041-0.016*A-0.093*B-0.0009250*C+0.035*A*B+0.0003500*A*C+0.006800*B*C+0.011*A2+0.093*B2-0.009630*C2应用响应面分析，研究了各因素与响应值之间的对应关系，确定了提取工艺的最佳条件为:乙醇浓度70％，料液比1∶60，超声时间45min，超声功率140W，超声温度55℃。
　　 3.采用不同极性的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇四种有机溶剂依次对乙醇提取物浸膏进行分级萃取，结果显示前三者的萃取组分均对乙酰胆碱酯酶有较强抑制活性，而水饱和正丁醇未检测出抑制活性。表明发酵大豆中抑制乙酰胆碱酯酶的活性物质极性较弱。
　　 4.利用十种不同型号的大孔吸附树脂对乙酸乙酯相中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行富集试验，筛选出ADS-17大孔树脂为适宜分离乙酰胆碱酯酶抑制剂的树脂;其静态吸附率和解析液抑制率分别为96.65％和64.24％，适宜的解析液为80％乙醇溶液;用80％乙醇溶液进行动态解析时，解析速度为1.0mL/min时解析效果较好，此时解析液对AChE抑制率为62.64％。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的及意义

1．2 豆豉活性成分的研究进展

1．2．1 大豆异黄酮

1．2．2 大豆低聚糖

1．2．3 大豆皂苷

1．2．4 大豆多肽

1．2．5 豆豉纤溶酶

1．3 乙酰胆碱酯酶抑制剂

1．3．1 临床上使用的乙酰胆碱酯酶抑制剂

1．3．2 植物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂

1．4 活性物质提取分离的方法

1．4．1 活性物质传统提取分离方法

1．4．2 活性物质新型提取分离方法

1．5 本课题研究的主要内容

1．5．1 发酵大豆原料的选择

1．5．2 超声波辅助提取工艺优化

1．5．3 有效极性部位的确定

1．5．4 大孔吸附树脂对发酵大豆提取物乙酰胆碱酯酶抑制剂的富集

1．6 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 发酵大豆试样的制备

2．2 仪器与设备

2．3 试验方法

2．3．1 发酵大豆原料的选择

2．3．2 超声波辅助提取试验

2．3．3 有效极性部位的确定

2．3．4 大孔吸附树脂初步分离发酵大豆提取液中乙酰胆碱酯酶抑制剂

2．4 乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定

2．5 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 发酵大豆原料选择试验结果

3．1．1 发酵前不同原料对乙酰胆碱酯酶的抑制活性

3．1．2 发酵时间对不同发酵原料乙酰胆碱酯酶抑制活性的影响

3．1．3 小结

3．2 超声波辅助提取试验结果

3．2．1 超声波提取优化单因素试验结果

3．2．2 响应面试验结果与分析

3．2．3 小结

3．3 有机溶剂分级萃取试验结果

3．4 大孔树脂对乙酰胆碱酯酶抑制剂的富集

3．4．1 大孔树脂的筛选

3．4．2 D101、AB-8、ADS-17大孔树脂静态吸附曲线

3．4．3 D101、AB-8、ADS-17大孔树脂静态解析动力学曲线

3．4．4 不同乙醇浓度对ADS-17大孔树脂解析液抑制率的影响

3．4．5 ADS-17大孔树脂动态梯度解析试验结果

3．4．6 ADS-17大孔树脂不同解析流速对动态解析的影响

3．4．7 小结

4 结论

参考文献

作者简介

致谢