猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表达及ELISA方法的建立

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状的传染病，又称猪蓝耳病。PRRS已成为当前困扰中国养猪业健康发展的主要烈性传染病之一。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株，通过与Genbank上发表的核苷酸和氨基酸序列进行对比，了解河北PRRSV的分子流行病学特点。以本地分离株为基础，克隆表达编码PRRS病毒粒子中含量最多、免疫原性最强蛋白的ORF7基因，构建成熟的原核表达系统，并将表达的N蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。
　　本研究从河北省多地送检的疑似PRRS阳性病料进行RT-PCR鉴定，将确诊的阳性病料接种Marc-145细胞，然后连续传代。其中河北新乐市送检病料接种Marc-145细胞后经过5代盲传后，出现典型细胞病变(CPE)，初步分离到一株病毒，暂命名为PRRSV HB-XL株。进一步对其ORF5与NSP2基因克隆测序，经同源性比较及系统进化树等分析，表明该毒株ORF5与NSP2基因与国内流行的缺失变异株遗传关系较近，与国内外经典美洲型毒株及基因重组毒株QYYZ遗传关系较远且与欧洲型LV毒株处于不同分支;ORF5基因编码的200个氨基酸的第13位、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R)，第137位为具有野毒特性的丝氨酸(S);与经典美洲株相比，该毒株NSP2基因分别发生3个碱基和87个碱基的不连续缺失。说明HB-XL株属于美洲型PRRSV并存在不断变异的趋势。
　　设计1对添加酶切位点的特异性引物扩增PRRSV HB-XL株的ORF7全基因，并与原核表达载体pET-32a连接，构建ORF7基因的原核表达系统pET-32a-N;将重组质粒转化入BL21感受态细胞，经IPTG的诱导表达，SDS-PAGE可检测到分子质量约为34.0kDa的目的蛋白;经Western-blotting分析，表明该重组蛋白具有良好的免疫原性;并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导时间为4h，IPTG浓度1.5mM，诱导温度为37℃的条件下目的蛋白表达量最大。将表达纯化后的N蛋白作为包被抗原，按一定的稀释度倍比稀释。采集PRRSV阳性猪血清，按一定稀释度倍比稀释。测定各步骤反应的条件，成功建立ELISA方法。重组抗原包被浓度为2.23μg/ml，37℃1h或者4℃过夜;封闭液为2％的明胶，37℃封闭1 h;血清1∶80稀释，37℃作用1h;酶标二抗1∶1000稀释，37℃作用40min;底物(TMB)室温显色15min;若检测的OD450＞0.363则为阳性，若检测的OD450＜0.34则为阴性。该方法与商业化的美国IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒的符合率为91.6％，其中相对敏感性为92.3％，相对特异性为90.4％，结果无显著差异。说明本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性，有很好的临床应用前景。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 PRRS的病原学

1．1．1 PRRSV的一般特性

1．1．2 PRRSV的基因组特点

1．2 PRRSV基因组遗传变异特点

1．3 PRRSV流行病学与发病机制

1．3．1 PRRSV的流行病学

1．3．2 PRRSV的发病机制

1．4 PRRS诊断方法的研究进展

1．4．1 临床诊断

1．4．2 病毒分离

1．4．3 血清学技术

1．4．4 分子生物学技术

1．5 研究目的及意义

2 PRRSV河北分离株ORF5与NSP2基因遗传变异分析

2．1 材料

2．1．1 病料

2．1．2 细胞

2．1．3 细胞培养用溶液

2．1．4 RNA提取用溶液及琼脂糖凝胶电泳所用溶液

2．2 方法

2．2．1 病料处理

2．2．2 病毒分离培养

2．2．3 病毒基因组总RNA的提取

2．2．4 RT-PCR引物设计合成

2．2．5 反转录合成cDNA及病毒的PCR鉴定

2．2．6 ORF5和NSP2基因的扩增和测序

2．2．7 ORF5和NSP2基因序列的比对分析

2．3 结果与分析

2．3．1 病毒分离鉴定

2．3．2 ORF5和NSP2基因的PCR扩增

2．3．3 ORF5基因同源性及遗传进化树分析

2．3．4 NSP2基因同源性分析

2．4 讨论

3 PRRSV HB-XL株ORF7基因的原核表达

3．1 材料

3．1．1 质粒、感受态与限制性内切酶

3．1．2 RNA提取用溶液及琼脂糖凝胶电泳所用溶液

3．1．3 目的基因转化用试剂

3．1．4 SDS-PAGE试剂

3．2 方法

3．2．1 病毒基因组总RNA的提取

3．2．2 PRRSV ORF7基因的RT-PCR扩增

3．2．3 PCR产物的回收纯化

3．2．4 原核表达载体pET-32a-N的构建

3．2．5 重组质粒转化

3．2．6 重组质粒的鉴定

3．2．7 重组表达菌株的诱导表达及条件优化

3．2．8 SDS-PAGE分析

3．2．9 重组蛋白的可溶性检测

3．3 结果与分析

3．3．1 N基因的PCR扩增

3．3．2 阳性重组质粒的菌液PCR鉴定

3．3．3 pET-32a-N表达载体N基因测序鉴定

3．3．4 重组蛋白优化条件下的表达

3．3．5 重组蛋白的可溶性检测

3．4 讨论

4 PRRSV HB-XL株N蛋白的表达、纯化及间接ELISA检测方法的初步建立

4．1 材料

4．1．1 质粒

4．1．2 血清及抗体

4．1．3 试剂盒

4．1．4 SDS-PAGE用溶液

4．1．5 Western blot用溶液

4．1．6 间接ELISA用溶液

4．2 方法

4．2．1 重组蛋白的表达及纯化

4．2．2 纯化的N蛋白浓度测定

4．2．3 重组N蛋白的Western blot鉴定

4．2．4 PRRSV N-ELISA检测方法的初步建立

4．2．5 PRRSV N-ELISA检测方法的特异性试验

4．2．6 PRRSV N-ELISA的重复性试验

4．2．7 与商业化试剂盒对比

4．3 结果与分析

4．3．1 重组N蛋白的纯化

4．3．2 重组N蛋白的Western blot鉴定

4．3．3 PRRSV N-ELISA检测方法工作条件的确定

4．3．4 PRRSV N-ELISA检测方法的特异性试验结果

4．3．5 PRRSV N-ELISA检测方法的重复性试验结果

4．3．6 与商业化试剂盒检测结果对比

4．4 讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

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致谢