印度芥菜BjSMT基因的功能鉴定和转EeAP2.1/EeAP2.2烟草的RNA-Seq分析

摘要

硒是GSH-Px、IDI、TrxR等多种酶的组成成分。硒具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌症和抗衰老等功能，同时，硒可以拮抗（镉、铅等）或协同（锌、汞等）许多重金属，解除重金属的毒性。印度芥菜（Brassica juncea L.）作为被广泛研究的重金属超累积植物，对Cd、Ni、Zn、Cu和Se等都有富集效果，且富集重金属浓度范围广。硒代半胱氨酸甲基转移酶是硒元素在有机体内代谢途径的关键酶，由SMT基因编码，其对硒元素的解毒机制是将参与蛋白合成的SeCys转化成非蛋白氨基酸MeSeCys，因而不能替代硫代半胱氨酸参与到蛋白合成中，实现植物对硒的超富集。
　　AP2/EREBP类转录因子参与信号级联放大系统和转录调控基因表达，是一类植物特有的、与胁迫应答有关的转录因子超家族。EeAP2.1、EeAP2.2属于长穗偃麦草AP2/EREBP类转录因子，含有AP2保守结构域。近年来，植物抗逆调控网络的研究越来越多，但对AP2/ERF家族转录因子调控网络的研究仍有较大空白，并且在长穗偃麦草中，此类转录因子未见报道。利用高通量测序技术，获得大量的基因组表达谱数据，可以对植物转录因子在生物及非生物逆境抗性中的作用机理进行整体、深入的研究，全面认识转录因子调控网络，为利用转录因子进行植物抗逆基因工程改良提供理论依据。
　　通过对BjSMT转基因烟草与空载体转化烟草进行不同浓度亚硒酸钠胁迫，测定相关生长指标和生理指标，进行该基因的富硒功能研究;通过对EeAP2.1和EeAP2.2转基因烟草的RNA-Seq分析，解析二者所影响的抗逆代谢途径，揭示其抗逆相关的分子基础。取得的实验结果如下:
　　1.在0～240μM不同亚硒酸钠浓度处理下，BjSMT转基因烟草在株高、鲜重等表型特征上均优于空载体烟草。
　　2.测定了上述不同亚硒酸钠浓度处理下BjSMT转基因烟草和空载体烟草的叶绿素含量和GSH-Px活性，结果表明BjSMT转基因烟草比空载体烟草更耐受亚硒酸钠胁迫，显示了BjSMT基因过表达植株对高浓度亚硒酸钠有较强的耐受性。
　　3.测定了0～120μM亚硒酸钠胁迫处理下的烟草总硒含量，结果显示，BjSMT转基因烟草和转空载体烟草本底总硒含量极少，而亚硒酸钠处理时，过表达BjSMT可显著提高烟草的总硒含量，表明BjSMT转基因烟草的硒富集能力优于转空载体烟草。
　　4.构建了pBI121-EeAP2.1、pBI121-EeAP2.1-GFP、pBI121-EeAP2.2和pBI121-EeAP2.2-GFP真核表达载体，获得了相应载体的转基因烟草植株，并在基因水平上鉴定转化成功。
　　5.利用qRT-PCR分析了苗期长穗偃麦草在10％PEG6000，125mM NaCl，4℃低温和20μM CdCl2胁迫条件下EeAP2.1和EeAP2.2的转录表达谱，初步鉴定了EeAP2.1主要响应干旱胁迫，而EeAP2.2主要响应高盐和低温胁迫。
　　6.利用RNA-Seq技术分析了EeAP2.1和EeAP2.2转基因烟草的转录组，结果显示EeAP2.1转基因烟草和空载体烟草对比，差异基因在光合系统、水解酶活性、膜蛋白复合物、倍半萜类和三萜类生物合成和植物激素信号转导途径等途径增强植物的抗旱性。EeAP2.2转基因烟草和空载体烟草对比，差异基因在光合作系统、昼夜节律-植物、ABC运输、二苯乙烯类和姜酚生物合成、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、锚定生物合成等途径增强植物的抗盐性和低温耐受性。

目录

声明

摘要

1引言

1．1．1干旱、高盐、低温对植物的影响

1．1．2重金属对植物的影响

1．2硒的自然分布与作用

1．2．1硒的自然分布与富硒植物

1．2．2硒对癌症、疾病的作用

1．3硒代半胱氨酸甲基转移酶研究进展

1．3．1硒在植物体内的吸收、转化机制

1．3．2硒代半胱氨酸甲基转移酶

1．4 AP2／EREBP家族转录因子

1．5 RNA-Seq技术

1．6本研究的意义

第一部分印度芥菜BjSMT基因的功能鉴定本章概述

2．1供试材料

2．2 BjSMT转基因烟草植株的鉴定和胁迫

2．3转基因烟草功能分析

3结果与分析

3．1 BjSMT转基因烟草鉴定与生物信息学分析

3．2 BjSMT在转基因烟草中的功能鉴定

4讨论

4．1关于硒代半胱氨酸甲基转移酶

4．2关于植物体内硒形态研究

5本章结论

第二部分转EeAP2．1和EeAP2．2烟草的RNA-Seq分析

2材料与方法

2．1供试材料

2．2实验方法

3结果与分析

3．1 EeAP2．1和EeAP2．2烟草表达载体的构建

3．2 EeAP2．1和EeAP2．2转基因烟草的筛选与鉴定

3．3野生型长穗偃麦草中EeAP2．1／EeAP2．2基因表达谱分析

3．4 EeAP2．1和EeAP2．2转基因烟草的RNA-Seq分析

4讨论

4．2关于转录组学分析

5本章结论

参考文献

在读期间发表论文及申报专利

作者简历

致谢