根癌农杆菌拮抗真菌的筛选、发酵及有机锡新化合物抗TMV、抗癌机制研究

摘要

本文分为两个部分。第一部分是针对目前根癌病的生防细菌不耐旱，寿命短的缺点，首次从果树根系土壤中筛选拮抗根癌农杆菌的生防真菌，并确定生防真菌的发酵条件，为植物根癌病生防菌株的开发及应用扩大菌种资源；另一部分是针对目前防止TMV的一般药剂很难在不伤害寄主的情况下抑制病毒增殖，首次对南开大学李正名院士提供的有机锡新化合物04-W0319进行了抗TMV活性及机制的研究，并在此基础上对04-W0319的抗肿瘤机制进行了系统研究，为开发低毒、高效的有机锡新化合物，拓展其应用范围提供参考依据。在第一部分的研究中，从我国12个省市采集的土样中分离纯化出152株真菌，采用琼脂柱初筛，得到2株抗根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens T-37(简称 T-37)的真菌菌株，通过滤纸片法进行对比复筛，证实了此2株菌株对根癌农杆菌具有拮抗作用。根据Raper (1965)关于曲霉属的分类标准，拮抗1号真菌菌株的主要形态特征与他所描述的黑曲霉(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的标准形态基本相同，鉴定该菌株属于曲霉属黑曲霉群的一株黑曲霉，记为黑曲霉xj (Aspergillus niger xj)，并将该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心。根据Brown & Smith(1957)的分类标准，拮抗2号菌株鉴定为轮枝拟青霉，记为轮枝拟青霉49-01 (Paecilomyces verticillatus 49-01)，为新种。对xj菌株进行单孢子分离，获得8个单孢子株，分别记为xj-1、xj-2、xj-3、xj-4、xj-5、xj-6、xj-7、xj-8。通过对菌落生长情况，产孢量、分生孢子的萌发率、对T-37抑制活性的综合比较，认为xj-5为优势单孢子株，并对其继代培养后的培养性状及对T-37的抑制活性进行了考察，xj-5单孢子株所表现出的遗传性状较为稳定并且所产生的抑菌圈直径(20.13±0.09 mm)高于对照xj菌株(18.28±0.21 mm)。以xj-5单孢子株作为出发菌株，对其发酵工艺条件进行探索。对培养成分中2％的麦芽糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘油6种碳源和3％的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸铵、氯化铵、脲素6种氮源进行单因素筛选，选择麦芽糖、蔗糖为碳源，酵母膏、蛋白胨为氮源，并设计L9(34)正交实验对C／N进行优化。确定xj-5菌株的发酵培养基组成为：麦芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％。对培养条件中的不同接种量、装液量、培养温度及发酵培养基起始pH值分别进行了筛选。确定xj-5菌株的发酵培养条件为：接种15％、摇瓶装液量10％、培养温度25℃、发酵培养基起始pH自然。根据以上筛选出的培养基成分和培养条件，将xj-5菌株接种摇瓶培养，每隔24h定时取样，测定生物量和抑菌圈直径，绘制发酵动态曲线。结果显示：xj-5菌株直接进入对数生长期，无生长延迟期，这可能是因为加入的液体母种活力强，并且培养条件的差异不大，菌株能很快适应发酵环境，直接进入快速生长期，并且这段时间较长(1-8d)，生物量在第8天的时候达到了最大(161.24g／L)，同时抑菌成分也在不断分泌与积累。随后延迟期(9-12d)持续了较长的时间，并在当在第10天的时候，代谢产物的累积达到了高峰，抑菌圈直径达到最大(54.48 mm)。随着发酵培养基营养的耗尽，衰老期的出现(13-15d)，毒素的累积及菌体自溶导致生物量急剧下降，而细胞内容物的流出和细胞碎片的产生导致发酵培养基pH值的变化，直接影响着xj菌株的抑菌成分的活性，以致抑菌圈直径也急剧下降。因此，根据xj-5菌株的发酵动力学的模型，确立xj-5菌株抑菌活性成分的发酵工艺为：制备麦芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％，pH自然的发酵培养基，将xj-5菌株按15％的接种量，接种到装液量为10％的液体发酵培养基中，25℃，120rpm，摇瓶培养10d，收集菌丝体制备发酵浓缩液，滤纸片法测xj-5菌株的抑菌圈直径达54.48 mm。 第二部分的研究以心叶烟为材料，得到有机锡新化合物04-W0319对烟草花叶病毒侵染的治疗效果为49.38％；钝化效果为73.23％；保护效果为48.82％。 500μg/L 04-W0319与TMV体外作用30min，电镜下观察，显示病毒粒体出现断裂现象，粒体结构受到了破坏；琼脂糖凝胶电泳显示04-W0319对TMV-RNA具有体外降解作用；TMV-CP的UV测定结果反映了04-W0319对烟草花叶病毒的体外聚合过程具有抑制作用。对普通烟K326的PAL、POD和SOD的活性进行了测定。PAL活性测定结果表明：500μg/L 04-W0319处理的烟苗在第7天达到酶活高峰值，第9天降到最低，并且烟草在接种TMV后再用04-W0319处理可使酶活性增加。POD活性测定结果表明：单独用04-W0319处理的酶活在第7天达到酶活高峰值，烟草在接种TMV后再用04-W0319处理也可使酶活性增加，在第9天达到酶活高峰值，并高于其它处理。SOD活性测定结果表明：TMV处理的酶活于第5天达到一个高峰值，随后酶活在第9天又达到另一个高峰值，接种TMV后再用04-W0319处理的与发病对照的酶活趋势一致，单独用0-W0319处理的烟苗酶活在第5天达到高峰值，并高于其它处理组。 K326的胞间蛋白经SDS-PAGE不连续电泳分析表明：化合物04-W0319对K326的胞间蛋白影响不大，并且对PR蛋白的诱导也不强。 04-W0319对寄主叶绿素含量的影响实验结果显示：TMV感染后使得烟草叶片中叶绿素的含量大大降低，04-W0319处理的烟草叶片叶绿素含量有所提高，说明04-W0319能够减少病毒对烟草叶片中叶绿体的破坏作用，增加了叶绿素的含量，从而提高寄主的抗病性；但药剂处理烟草叶片的叶绿素含量仍然低于健康对照，这也说明04-W0319不能完全抑制病毒对叶绿素的破坏作用。因此，04-W0319一方面可在体外与TMV作用，降低TMV的侵染率；另一方面可提高寄主防御酶系活性和增加叶绿素含量，提高寄主抗性，抵御TMV的侵染。以PC3、Bcap-37和BGC823肿瘤细胞为材料，04-W0319作用72h对PC3细胞的IC50为0.13 μg／mL：作用48h对Bcap-37细胞的IC50为0.18pg／mL：作用48h对BGC823细胞的IC50为0.17 μg／mL。细胞毒性实验初步判断：04-W0319诱导3株细胞死亡主要不是通过细胞毒性。划痕标记法实验表明04-W0319可降低3株细胞的运动能力而抑制肿瘤细胞的生长。细胞形态学观察及细胞培养液上清中LDH活力测定表明：72h内凋亡始终是04-W0319诱导PC3和Bcap-37细胞死亡采用的主要方式；48 h内凋亡始终是04-W0319诱导BGC823细胞死亡采用的主要方式。流式细胞分析术检测结果进一步揭示：0.15 μg/mL 04-W0319作用48h，将PC3或Bcap-37细胞阻滞在G2／M期而抑制细胞的生长、繁殖；当作用时间延长或作用浓度增高时，以诱导细胞发生凋亡为主；对BGC823细胞，0.15 μg／mL 04-W0319作用48h，将细胞阻滞在G0／G1期，并伴随诱导凋亡而抑制细胞的生长、繁殖；但随着作用时间的延长，04-W0319将BGC823细胞周期阻断在G2／M期，并伴随着细胞发生坏死。免疫印迹(Western Blot，WB)实验结果显示：04-W0319可激发PC3、Bcap-37细胞p21蛋白的表达，从而阻碍了细胞通过细胞周期G2／M期的限制点，抑制细胞的生长。而对BGC823细胞，04-W0319通过抑制CyclinD蛋白的表达，阻碍了细胞通过细胞周期G0/G1期的限制点，抑制细胞的生长。总的来说，04-W0319对3株细胞中的CDK2和CDK4都没有影响，提示04-W0319的作用靶标相对专一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词列表

声明

前言

第一部分根癌农杆菌拮抗真菌的筛选及发酵条件的研究

一文献综述

1.1植物根癌病防治研究进展

二研究路线设计

2.1研究的目的和意义

2.2研究内容及路线

三实验与方法

3.1供试材料

3.2实验方法

四结果与讨论

4.1根癌农杆菌拮抗真菌的筛选结果

4.2拮抗菌株的鉴定

4.3 xj单孢子菌株生长、产孢及抗T-37活性的比较

4.4培养基成分对xj-5菌株抑菌活性的影响

4.5培养条件对xj-5菌株抑菌活性的影响

4.6 xj-5菌株的发酵动力学

第二部分有机锡新化合物抗TMV、抗肿瘤活性及机制的研究

一文献综述

1.1有机锡化合物的生物活性研究进展

二研究思路

2.1研究的目的和意义

2.1研究内容及路线

三材料和方法

3.1实验材料

3.2实验方法

四结果与讨论

4.1化合物04-W0319抗烟草花叶病毒作用机理的研究结果

4.2化合物04-W0319抗肿瘤机制的研究结果

结论

1主要成果

1.1根癌农杆菌拮抗真菌的筛选与发酵工艺条件的研究

1.2有机锡新化合物抗TMV、抗肿瘤活性及机制的研究

2创新点

3存在问题

致谢

参考文献

附录 发表文章及专利