基于PLGA膜与Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经的研究

摘要

本文主要从以下几部分展开论述:
　　第一部分 Necl-1蛋白对雪旺细胞生物学特性的影响
　　背景:目前周围神经缺损的治疗效果尚不十分理想，研究组织工程神经修复周围神经缺损得到许多关注，常用的种子细胞是雪旺细胞(SCs)，但是现存的问题是其与支架材料的粘附力不足，影响了组织工程化神经的构建及其效果。如增加细胞与载体之间的粘附力，提高载体上的细胞数量，有望改善其效果。
　　目的:研究Necl-1蛋白对体外培养的SCs的影响，观察SCs的生物学特性，主要考察其对SCs增殖、粘附和形态维持作用及GDNF、BDNF和CNTF等神经营养因子的影响。
　　方法:使用RSC96雪旺细胞进行体外培养，扩增培养备用， MTT法测定不同浓度的Necl-1对SCs的影响，筛选出三个较佳浓度(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)。用筛出来的三个较佳浓度的Necl-1进一步干预SCs，不加Necl-1为对照，分别于2d、4d和6d，通过检测细胞增殖、细胞活力FDA/PI荧光染色，苏木精-伊红染色，S-100b免疫组化测定及细胞RNA提取和实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)检测GDNF、BDNF、CNTF、S-100b基因表达量，进一步考察Necl-1对SCs的促进作用。
　　结果:MTT细胞毒性试验结果显示当Necl-1浓度为50μg/ml时，其对SCs的增殖促进作用最明显，浓度为250μg/ml后开始出现抑制作用。细胞增殖实验中，发现Necl-1各组在2d、4d、6d时所测MTT值均较对照组要高。细胞的FDA/PI荧光染色中Necl-1各组与空白对照组死活细胞比例差别不大。HE染色的结果显示各组细胞形态上并没有差异，但Necl-1各组在细胞密度方面较空白对照组大，且在浓度50μg/ml时达到最大。当Necl-1在浓度为50μg/ml时，分别在第4d、6d天的OD值相对较高。通过对SCs的S-100b免疫组化进行染色，发现Necl-1各组的SCs中S-100b阳性表达较对空白对照组相比有明显增加，且50μg/ml浓度的Necl-1培养SCs，其S-100b表达量最大。在基因表达方面，发现Necl-1各组中GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表达量较对照组均有显著上调。SCs在Necl-1浓度为50μg/ml下培养4d、6d时其CNTF、GDNF、S-100b的表达能力最强。而BDNF在2d时各组表达差异不大，但在4d时浓度为25μg/ml表现较为明显的促进作用，6d则为50μg/ml有较强的促进作用。
　　结论:实验结果表明，适当浓度的Necl-1能促进SCs增殖和粘附，并能维持其细胞形态，增强GDNF、BDNF和CNTF等神经营养因子的表达，为SCs参与外周神经修复提供一个更为适宜的微环境。提示Necl-1为制备更为稳定的组织工程神经提供可能。
　　第二部分 基于PLGA和Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经
　　背景:聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是由乳酸和羟基乙酸两种单体随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，因此是一种广泛应用的组织工程神经支架。基于PLGA膜材料并结合Necl-1蛋白构建组织工程化神经，考察Necl-1对SCs的增殖粘附作用以及特异的锚定作用，探索制备组织工程神经的新思路。
　　目的:通过蛋白因子结合组织工程技术，为周围神经修复提供新模型，检测SCs的相关生物学特性，探究SCs经Necl-1蛋白干预后在PLGA膜材料上的增殖及粘附情况。
　　方法:将PLGA膜材料表层均匀涂上Necl-1蛋白，使其Necl-1化。在PLGA膜上种植SCs，在不同组间分别加入较佳浓度的Necl-1蛋白（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）进行试验。分别于2d、4d和6d三个时间点测定MTT细胞增殖量，考察PLGA膜联合Necl-1蛋白对SCs的增殖粘附作用的影响;通过FDA/PI，H&E染色观察不同浓度下SCs形态特性的变化;通过S-100b免疫组化试验检测SCs特异蛋白的表达水平。采用RT-PCR检测相关基因GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表达。运用电子显微镜(SEM)观察细胞在PLGA膜上生长情况及形态特征。
　　结果:SCs能较好地粘附于PLGA膜材料上生长。MTT细胞增殖实验在2、4、6d三个时间点上Necl-1各组均较空白对照组结果要好，尤其以N2（50μg/ml）浓度为最佳。细胞增殖实验的结果显示各组的OD值均较同期的无PLGA膜要高，其中N1、N2在4d、6d时间点上对细胞的增殖作用表现较好。通过H&E染色观察可知其细胞形态并没有改变，Necl-1各组细胞在4、6d时成簇生长明显。 FDA/PI荧光染色检测细胞活性，结果表明死活细胞比例方面空白组与药物组差别不大。免疫组化方面，N2（50μg/ml）浓度下SCs的S-100b表达量相对较高。对于Necl-1组基因表达的情况，实验得出无论GDNF、BDNF、CNTF、S-100b，其表达水平均大于空白对照组，随着培养时间的延长其表达水平均有显著上升，其中仍以N2（50μg/ml）浓度最强。扫描电子显微镜(SEM)的结果显示PLGA二维支架接种SCs2d、4d和6d后，细胞能较稳定的粘附在支架表面铺展生长，部分细胞可向膜内嵌入生长。随着时间的延长，粘附在支架上的细胞数量明显增加。同时间点的N2（50μg/ml）组与空白对照组相比，N2组的细胞量明显高于空白对照组，且N2组细胞表面有大量突触形成。
　　结论:结合Necl-1蛋白体外构建组织工程化神经更为稳定和优越，Necl-1蛋白有利于促进SCs在PLGA膜材料上增殖和粘附生长，对其表型及功能的维持有一定积极意义。基于PLGA和Necl-1蛋白体外构建组织化神经具有一定可行性，为进一步用于坐骨神经缺损动物模型提过依据和参照。

目录

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个人简历

摘要

第一部分 Necl-1蛋白对雪旺细胞生物学特性的影响

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 基于PLGA和Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

附录 英文缩略语对照

综述 生物材料修复周围神经损伤的研究进展

致谢

攻读硕士研究生期间发表的学术论文