壮药狗肝菜多糖对放射后大鼠颌下腺细胞生长活性及增殖修复的影响

摘要

目的：研究狗肝菜多糖预处理大鼠SMG细胞后，放射损伤模型下SMG细胞的生长增殖能力及DNA断裂修复能力。探讨狗肝菜多糖是否可增强辐射性SMG细胞的DSBs修复情况，为开发新的抗辐射药物提供实验依据。 方法：采取水提醇沉法从狗肝菜干燥全草中获取狗肝菜粗多糖，蛋白酶解法脱去蛋白质，H2O2氧化法脱去色素，透析法去除小分子物质，并用苯酚-硫酸法测定狗肝菜粗多糖中的糖含量。DEAE-52纤维素层析柱对除杂后的狗肝菜粗多糖进一步纯化，获取均一多糖组分狗肝菜精多糖。应用机械胰酶联合法进行体外大鼠SMG细胞原代培养。用60Coγ射线放射SMG细胞0、5、8、10Gy，建立辐射损伤模型。用不同浓度狗肝菜多糖进行干预。实验分为五组:空白对照组（不做任何处理）;辐射损伤组(放射8Gy);狗肝菜多糖低剂量组（浓度为40μg/ml+放射8Gy）;狗肝菜多糖中剂量组(浓度为60μg/ml+放射8Gy);狗肝菜多糖高剂量组（浓度为80μg/ml+放射8Gy）。CCK-8法检测各组SMG细胞生长抑制率。流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测细胞周期及细胞凋亡百分率。蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测MRN复合体(Mre11/Rad50/Nbs1)的表达情况。 结果：本次实验所提取的狗肝菜多糖中，多糖含量为90.5％。体外培养的大鼠SMG细胞大部分呈多边形或三角形、少数为长梭形，组织块周边会有散在少量成纤维样梭形细胞。每7-10天传代，第一代细胞形态较好，增殖能力较强，可传代至第三代细胞，第三代细胞生长活力明显下降，凋亡的细胞变多，镜下可观察到较多的漂浮细胞碎片。CCK-8结果显示，放射后SMG细胞存活率随放射剂量增大而降低，随放射后时间增长先下降后逐渐回升。狗肝菜多糖能提高放射后SMG细胞的增殖能力，且细胞生长活力与狗肝菜多糖浓度呈正相关。流式细胞仪检测SMG细胞凋亡结果提示狗肝菜多糖能明显降低放射后细胞总凋亡率，特别是早期凋亡率;细胞周期结果显示狗肝菜多糖能有效的减少放射后S、G2期细胞数，缓解S、G2期阻滞。Western Blot结果显示:辐射损伤组细胞内Mre11、Rad50、Nbs1表达降低，狗肝菜多糖不同浓度处理组Mre11、Rad50、Nbs1表达则是随着药物浓度增加而升高。 结论：电离辐射诱导SMG细胞双链DNA损伤，S、G2细胞周期阻滞，抑制细胞生长。狗肝菜多糖可通过降低放射后SMG细胞凋亡比例和缓解SMG细胞S、G2期阻滞来发挥辐射防护作用。狗肝菜多糖也可通过上调MRN复合体三个亚基表达量，从而促进DSBs修复功能，以减轻电离辐射所致的损伤。狗肝菜多糖初步具有促进电离辐射导致的细胞损伤修复的功能。发掘狗肝菜提取物狗肝菜多糖成为抗辐射药物的可能具有研究价值。