藁本内酯对RANKL诱导的破骨细胞生成和钛颗粒诱导的颅骨骨溶解的作用机制研究

摘要

骨骼是一种动态的有机组织。骨稳态的维持有赖于破骨细胞和成骨细胞的功能平衡。其中，破骨细胞是骨吸收的唯一细胞，在骨骼的形成及骨密度的调节中发挥重要作用。破骨细胞的分化及功能异常而导致很多骨性疾病，包括骨质疏松症、骨关节炎、类风湿性关节炎、牙周炎、Paget's病、恶性骨肿瘤及假体无菌性松动等。因此，调节破骨细胞形成和功能异常能够预防和治疗病理性骨丢失。 人工关节置换术是外科领域最重要创新之一，是治疗各种终末期关节疾病的有效方法。磨损颗粒诱导的骨溶解所致的假体无菌松动是其远期的并发症。磨损颗粒通过直接和间接的方式激活破骨细胞，引起骨吸收，最终导致假体的无菌松动。虽然近年来的研究致力于材料的改进以达到减少磨损颗粒，延长假体使用寿命的目的，但是不能完全避免磨损颗粒的产生。因此，新药的研发也是目前的热点。 目前用于防治颗粒诱导的假体无菌松动的药物，如双膦酸盐、地诺单抗等，长期应用有许多的副作用。因此从自然产物中提取有效药物治疗骨溶解相关疾病是近年来的研究热点。藁本内酯(Ligustilide，LIG)是从植物当归挥发油的主要成分。目前研究表明藁本内酯有抗炎、抗菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤及神经保护等作用，但是其对破骨细胞的作用以及防治磨损颗粒诱导的假体无菌松动的效果仍然不清楚。 我们通过前期研究发现，藁本内酯呈剂量依赖性地抑制破骨细胞的形成。因此本研究将进一步探究藁本内酯抑制破骨形成和防治颗粒诱导的骨溶解的机制，为藁本内酯未来在临床的应用提供的分子生物学和动物学研究基础。 第一部分 藁本内酯对破骨细胞分化和功能的影响 目的：体外研究藁本内酯对破骨细胞生成和和功能的影响。 方法：体外提取培养C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞(BMMs)，用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导，同时加入不同浓度的藁本内酯，培养5天，行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，计数各组破骨细胞数量，并进行统计分析;用MTS法测定藁本内酯对破骨细胞前体的细胞毒性，并计算IC50;BMMs接种于96孔板，用RANKL诱导，同时加入不同浓度的藁本内酯，培养5天，应用鬼笔环肽/DAPI染色，在共聚焦显微镜下拍照，观察藁本内酯对F-actin环形成的影响;BMMs接种于6孔板中诱导小破骨生成，之后接种到羟基磷灰石骨板上，加入藁本内酯进行干预，3天后在显微镜下拍照，并计算骨吸收面积。 结果：破骨细胞形成实验显示藁本内酯(2.5、5、10及20μM)呈剂量依赖性抑制破骨细胞的生成;细胞毒性实验显示在藁本内酯作用48小时，浓度低于或等于40μM对破骨前体细胞无毒性作用，IC50为602.95μM;F-actin染色结果显示，藁本内酯呈剂量依赖性抑制F-actin环形成，统计分析结果也支持这一结论;骨吸收实验结果表明藁本内酯（2.5、5和10μM）呈剂量依赖性抑制破骨细胞骨吸收面积。 第二部分 藁本内酯对破骨细胞分化和功能的影响的机制研究 目的：体外研究明确藁本内酯抑制破骨细胞生成和活化的分子机制。 方法：运用qRT-PCR检测藁本内酯对破骨细胞相关基因的表达，包括V-ATPase d2、DC-STAMP、TRAP、CTSK、RANK和NFATc1;运用Western Blot技术检测藁本内酯对RANKL诱导的细胞信号通路的影响，包括NF-κB、MAPK和ITAM信号通路的影响，尝试寻找藁本内酯的作用靶点。 结果：qRT-PCR检测显示，与对照组相比，藁本内酯抑制破骨细胞相关基因V-ATPase d2、DC-STAMP、TRACP、CTSK、RANK及NFATc1的表达，且呈剂量依赖性;Western Blot结果显示藁本内酯能够抑制NF-κB信号通路IκB的降解和p65磷酸化，抑制MAPK信号通路ERK和p38的磷酸化，抑制ITAM信号通路Gab2和PLCγ2的磷酸化，另外还可以下调上游细胞因子TRAF6的磷酸化。 第三部分 藁本内酯对成骨细胞分化和功能的影响 目的：研究藁本内酯对成骨细胞生成和功能的影响。 方法：体外运用新生SD乳鼠的头盖骨提取培养成骨前体细胞，用MTS法测定藁本内酯对成骨细胞前体的细胞毒性，并计算IC50;成骨前体细胞接种于48孔板，加入成骨诱导液（包括β-甘油、地塞米松和维生素C），诱导14天进行碱性磷酸酶染色，培养21天进行茜素红染色，评价藁本内酯对成骨细胞生成和功能的影响。 结果：细胞毒性实验显示在藁本内酯作用48小时，浓度低于或等于40μM对成骨骨前体细胞无毒性作用，IC50为265.3μM;碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示藁本内酯(2.5、5、10及20μM)对成骨细胞的生成和矿化无明显影响。 第四部 分藁本内酯对钛颗粒诱导的颅骨骨溶解的保护作用 目的：体内研究研究藁本内酯对钛颗粒诱导的颅骨骨溶解模型的保护作用。 方法：建立钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解动物模型，分成4组，包括假手术组、阳性组、低浓度药物组(2.5mg/kg)和高浓度药物组(5mg/kg)，运用不同浓度藁本内酯干预14天，MicroCT扫描分析各组颅骨骨溶解情况，并进行骨质量参数的统计分析。通过病理组织切片染色对各组颅骨破骨细胞数量进行统计分析。肝肾病理切片分析藁本内酯体内代谢毒性。运用ELISA技术分析各组小鼠血清骨吸收相关指标和炎症因子水平的变化。 结果：在钛颗粒诱导的颅骨骨溶解模型中，Micro CT显示藁本内酯能够降低钛颗粒诱导的颅骨骨溶解，表现为穿孔率、穿孔数降低和骨体积分数升高。病理组织切片结果显示藁本内酯降低了颅骨感兴趣区域破骨细胞数量。肝脏和肾脏病理切片显示，治疗剂量的藁本内酯对小鼠没有肝肾毒性作用。ELISA检测显示藁本内酯干预降低了小鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-1β、RANKL、OSCAR及CTX-1水平，提高了血清OPG水平。 结论：(1)藁本内酯呈剂量依赖性抑制破骨细胞的生成、F-actin环形成、骨吸收功能和破骨相关基因V-ATPase d2、DC-SAMP、TRACP、CTSK、RANK及NFATc1的表达。(2)藁本内酯抑制破骨细胞生成和活化可能是通过抑制NF-κB/ERK/p38/ITAM信号通路完成的。其药物作用靶点有可能为RANK。(3)藁本内酯对成骨细胞生成和矿化没有影响。(3)藁本内酯对钛颗粒诱导小鼠颅骨骨溶解模型具有保护作用，且没有肝肾毒性。