红麻细胞质雄性不育系线粒体蛋白质组差异分析与不育相关基因的发掘

摘要

明确植物线粒体蛋白质的作用机理是揭示植物细胞质雄性不育(CytoplasmicMale Sterility，CMS)分子机理的关键。但迄今为止，尚未见到关于植物CMS系和保持系花药线粒体蛋白质组比较分析的报道。本研究以周瑞阳等选育的红麻CMS系和保持系为材料，利用红麻为无限花序，花药多且大的特点，直接提取CMS系和保持系花药线粒体蛋白质，采用最新的同重标签相对与绝对定量(iTRAQ)标记，通过二维液相色谱分离，结合串联质谱，分析了单核期不育系和保持系间花药线粒体的蛋白质组差异及差异蛋白质的分子功能；基于蛋白质组结果分析，建立了红麻CMS发生的分子模型。同时，采用同源克隆和RACE法，从保持系花药中克隆了不育相关的RPT4等5个基因的cDNA序列，并通过半定量RT-PCR和mRNA原位杂交，初步分析了RPT4和NAD4的时空表达规律。主要结果是：
　　1、红麻CMS系和保持系花药线粒体中，共鉴定出93个显著差异的蛋白质，这些蛋白质导致红麻CMS系表现为：
　　(1)能量代谢异常。表现为三羧酸循环紊乱，即苹果酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰辅酶A连接酶等上调或下调表达，阻碍氧化磷酸化第一步所需要还原当量NADH和FADH2的产生，导致碳、氮代谢障碍，影响绒毡层营养供应、花粉淀粉充实和花药组织的形成：呼吸链出现多重障碍，即复合体I、Ⅲ和复合体Ⅳ异常表达，阻碍了电子和质子的传递，使主呼吸途径呼吸效率下降，影响质子梯度和电化学势形成，激发交替呼吸途径（AOX1和AOX2上调）；质子运输耦联的磷酸化严重受阻，即复合体V中，具有跨膜运输与转动作用的F(O)装置（ATP6、ATP9内含子）和催化ATP合成的F(1)亚复合体（α、β、γ和OSCP亚基，α亚基内含子）异常，导致质子通过和ATP合成严重受阻。
　　(2)线粒体基因组受到损伤。由于呼吸链障碍、过氧化氢酶减少等原因，活性氧损伤呼吸链紧邻的线粒体DNA，引起DNA错配(DNA错配修复蛋白增加)，促进DNA加强复制(DNA促旋酶和(解)螺旋酶上调），促使RNA反转录（反转录酶类），以弥补DNA数量和质量的缺陷。
　　(3)线粒体基因的表达受到限制。即转录水平上，以RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ第二大亚)和RNA聚合酶Ⅲ(RNA polⅢRPC2亚基)为主的转录装置下调，分别限制了mRNA和tRNA、snRNA及rRNA的转录，成熟酶类的异常变化影响了RNA的剪接、加工和调节，RNA依赖的核质间的协调也受到破坏；翻译水平上，蛋白质正常翻译元件——如起始因子IF-2，延伸因子Tu、EF-Ts、ISS和核糖体亚基L17、S14、S8等的被上调或下调变化，阻碍了正常的蛋白质翻译过程和某些核糖体亚基的调控作用。
　　(4)物质运输、信号传递以及大量代谢途径异常。表现为许多蛋白折叠（热激蛋白、伴侣蛋白）和运输（TOM40、PPR药物运输蛋白等）相关的酶或运输体异常变化，影响质核间物质交流、信息传递，扩散毒副影响；大量代谢酶（AST、ALDH、MCCase等）异常表达，影响广泛的代谢通路。(5)线粒体发生和细胞分裂发生障碍。表现为蛋白质水解加强(MPP、多聚泛素、FtsH)、线粒体发生（PHB）和细胞分裂（细胞分裂蛋白）受阻，通过复杂的网络调控，诱发凋亡和死亡事件，导致雄蕊发育障碍。
　　2、基于上述结果分析，建立红麻细胞质雄性不育发生的“核质互作失调的多顺反子模型”。即核质动态平衡被破坏，引起线粒体的不育多顺反子表达，并反馈调节核基因表达，引起花药组织能量代谢障碍、毒副伤害等，使线粒体发生和细胞分裂异常，经程序化细胞死亡事件，导致雄性不育。
　　3、从保持系花药总RNA中，克隆了RPT4等5个CMS相关基因的cDNA序列，并初步分析了RPT4和NAD4的时空表达，为深入研究其分子功能奠定了基础。通过RPT4和NAD4在不育系和保持系中表达的比较认为，二者在花药的发育中都具有重要作用；转录水平上，不育系中RPT4在单核期相对下调表达，双核期则相对上调表达，与蛋白质的变化一致；而NAD4在转录水平上材料间不存在显著的表达差异，蛋白质水平上材料间的差异属于翻译或翻译后调控所致。
　　总之，红麻CMS系花药线粒体蛋白质的数量变化反映了活动亚细胞和细胞的一种状态变动，体现核质互作中大量蛋白质的整体效应，涉及复杂的代谢途径和调控网络。本研究为深入探讨上述差异蛋白相关的代谢和调节变化、或发掘新的雄性不育相关基因等奠定了基础。