寨卡病毒VLP疫苗的研制及埃博拉病毒快检方法的建立

摘要

寨卡病毒(zika virus，ZIKV)是由伊蚊传播的黄病毒属病毒，孕妇感染寨卡病毒后，可造成新生儿小头症。已有研究证实ZIKV感染为格林巴利综合征的病因之一;由于与我国接壤的越南等国爆发了ZIKV疫情，因此我国面临潜在的输入性风险。由于病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)与病毒粒子结构相似，而且不含病毒遗传物质，具有强免疫原性，能诱导机体产生高滴度抗体，是最为安全有效的疫苗研发策略。本研究选择毕赤酵母表达系统表达重组ZIKV囊膜蛋白(Env)，纯化重组蛋白后，体外组装VLP，动物实验评价了VLP疫苗免疫保护效力。 目的:本研究以ZIKV囊膜蛋白(Env)为研究对象，通过毕赤酵母表达系统获得重组ZIKV囊膜蛋白，体外组装成VLP，通过小鼠感染模型，进行免疫保护实验，验证VLP疫苗候选株保护力，为开发以VLP为基础，安全高效的ZKIV疫苗奠定前期研发基础。 方法:(1)构建重组表达质粒，利用毕赤酵母表达系统表达ZIKV囊膜蛋白，通过不同浓度zeocin抗生素，筛选高拷贝菌株。(2)诱导表达并纯化目的蛋白，首先采用镍离子金属鳌合层析柱对重组目的蛋白进行初步纯化，然后通过分子筛层析进一步的纯化，通过免疫印迹(Western Blot)和质谱检验目的蛋白是否成功表达。(3)根据不同离子强度和pH值的VLP组装缓冲液，筛选出VLP体外组装的最优条件，通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定VLP组装效果。(4)将获得的高纯度ZIKV VLP免疫小鼠，酶联免疫吸附测定(ELISA)和细胞中和实验检测小鼠体内诱导的抗体滴度变化，确认其体液免疫水平，酶联免疫斑点检测(ELISPOT)检测记忆性淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4细胞因子;胞内细胞因子染色，鉴定记忆性CD8+T和CD4+T细胞分泌INF-γ和IL-4能力，评价其细胞免疫水平，建立小鼠感染模型，攻毒实验验证ZIKV VLP疫苗侯选株对小鼠的保护力。 结果:(1)构建了重组表达质粒，经测序验证表明重组质粒构建正确。(2)通过Western Blot和蛋白质谱检测，证明了ZIKV Env获得成功表达。(3)通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定组装效果，证明了组装后的VLP呈球状，与天然ZIKV粒子大小基本一致，ZIKV VLP体外组装成功。(4)蚀斑减少中和试验(PRNT)证明了ZIKV VLP能够诱导生成高滴度的中和抗体，ELISPOT和胞内细胞因子染色分析，证明了可诱导机体产生强细胞免疫反应。(5)小鼠动物攻毒保护实验，证明了ZIKV VLP能够使免疫缺陷小鼠(A129)获得致死剂量病毒攻击的完全保护。 结论:利用毕赤酵母表达系统成功表达ZIKV Env，并在体外成功组装了VLP，免疫小鼠能实现完全保护，本研究获得的ZIKV VLP疫苗侯选株有望开发为一种安全高效的ZIKV疫苗。 另外，还研究了可在15min内检测埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)快速检测技术，将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫，以1mg/mL的EBOV-VP40单克隆抗体(McAb，4B7F9)和羊抗兔IgG，按2μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上，分别作为检测线与质控线，组装试纸条。该试纸条能够特异的检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(EBOV-VLP)和灭活EBOV，而与马尔堡病毒样颗粒(MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8(IAV/PR/8)、黄热病毒(YFV-17D)、登革热病毒2型(DEN2)无交叉反应，显示良好的特异性。本研究建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、高灵敏、特异地检测EBOV，为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。

目录

声明

摘要

主要英文缩写词

前言

第一章论文综述

1寨卡病毒综述

1．1寨卡病毒病原学

1．2寨卡病毒主要结构蛋白和非结构蛋白

1．3流行病学特征

1．4寨卡病毒感染的临床症状

1．5寨卡病毒的诊断

1．6寨卡病毒疫苗研究进展

1．7病毒样颗粒系统

1．8病毒样颗粒的特性

2埃博拉病毒综述

2．1埃博拉出血热病原学

2．2埃博拉出血热流行病学

2．3埃博拉出血热临床特征及病理特征

2．4埃博拉病毒疫苗进展

2．5免疫层析检测技术

1．1实验仪器

1．2实验试剂

1．3菌株

1．4常用缓冲溶液

2实验方法

2．1重组质粒的构建

2．2重组质粒的线性化

2．3重组质粒的提纯

2．4毕赤酵母X33感受态的制备

2．5毕赤酵母的电转化

2．6高抗性重组菌株的筛选

2．7阳性克隆的鉴定

2．8重组酵母菌株的诱导表达

2．9重组酵母诱导表达条件的优化

2．10重组酵母菌的发酵培养

2．11重组酵母表达重组蛋白的鉴定

2．12目的蛋白的纯化

2．13 Superdex 75TM分子筛层析进一步纯化

2．14目的蛋白SDS-PAGE和western Blot鉴定

2．15蛋白浓度测定

3实验结果

3．1高抗性重组菌株的筛选

3．2 pPICZA／PrM／E重组质粒菌液PCR及测序鉴定

3．3重组蛋白表达形式的鉴定

3．4重组蛋白表达条件的探索

3．5重组蛋白的纯化

3．6 Superdex 75TM分子筛层析纯化蛋白

3．7重组蛋白浓度测定

4讨论

4．1 Zika PrM／Env蛋白的优势

4．2表达系统的选择

4．3目的蛋白的纯化

5小结

第三章寨卡病毒病毒样颗粒疫苗组装、鉴定

1实验材料

2实验方法

2．1病毒样颗粒疫苗组装

2．2病毒样颗粒疫苗鉴定

3实验结果

3．1动态光散射结果

3．2透射电子显微镜结果

4讨论

5小结

第四章ZIKA病毒样颗粒疫苗的小鼠实验免疫研究

1实验材料

1．1细胞与病毒

1．2免疫原

1．3实验动物

1．4实验仪器

1．5实验试剂

2实验方法

2．1小鼠免疫

2．2小鼠攻毒

2．3细胞复苏、传代、冻存

2．4病毒扩繁

2．5病毒TCID50测定

2．6 ELISA检测

2．7中和抗体检测

2．8 ELISPOT检测

3实验结果

3．1小鼠体重变化

3．2攻毒存活率

3．3体液免疫反应评价

3．4 ELISPOT检测和胞内细胞因子染色

4讨论

5小结

第五章埃博拉病毒胶体碳免疫层析检测方法的建立

1实验材料

1．1实验仪器

1．2胶体碳实验试剂

1．3胶体碳试纸条用液

2实验方法

2．1 VLP的制备

2．2重组蛋白的制备

2．3抗体的制备

2．4单抗ELISA检测

2．5胶体碳试纸条的制备

2．6试纸条性能评价

3实验结果

3．1重组蛋白纯化

3．2抗体纯化

3．3单抗ELISA检测

3．4试纸条的组装和结果判定

3．5试纸条特异性检测

3．6试纸条灵敏性检测

4讨论

5小结

结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

攻读学位期间发表论文情况