耐高糖酿酒酵母菌株的筛选及性状诱发基因的功能研究

摘要

随着全球石化能源总量不断地减少，人类需求不断地增加，寻找新的替代能源是人类必须要解决的重大问题，生物燃料乙醇以其绿色环保、可再生等特点得到人们广泛的关注，中国已成为世界上继巴西、美国之后第三大生物燃料乙醇生产国和应用国。目前，世界上生产的燃料乙醇几乎全部都是由酿酒酵母发酵产生的，可见高性能的酿酒酵母菌株是燃料乙醇产业发展的重要因素。发酵过程中，酿酒酵母细胞发酵产乙醇的能力以及对发酵环境中各种不利因素的耐受性是酵母细胞工业应用的重要指标。因此，获得乙醇发酵能力和耐受性增强的酿酒酵母菌株以及研究其高产和耐受的生理机制是一项非常有意义的工作。高浓度糖造成的高渗压力是酿酒酵母细胞工业应用中常遇到的一种环境压力，早期对酵母耐高渗机制的研究主要是针对盐和山梨醇形成的高渗环境，对高浓度糖形成的高渗耐受机制研究还不多。
　　本研究以实验室之前筛选并保存的糖蜜乙醇发酵高产野生酿酒酵母菌株MF02为出发菌株，对其进行紫外诱变，筛选获得一株在40％(W/V)葡萄糖压力下生长和发酵产乙醇能力都比出发菌株提高的突变菌株UV02_HG。经测定，在YPD培养基中两菌株的生长曲线基本一致，突变菌株的平均最大细胞数由出发菌株的3.38×108提高到3.81×108。在YP40培养基中，突变菌株UV02_HG的生长和乙醇发酵情况明显优于野生菌株MF02，最大细胞数由野生菌株的6.857×108增加到8.767×108，比野生菌株增加了27.85％，最大乙醇产率由野生菌株的14.056％(V/V)提高到15.304％(V/V)，比野生菌株提高了8.88％。
　　对两菌株在YP40培养基中生长至指数生长期的基因表达情况进行转录组测序分析，测序分析结果显示，与野生菌株相比，突变菌株发生显著表达差异的基因有1203个，其中363个基因表达上调，840个基因表达下调，发生显著SNP突变的基因有1846个，其中269个同时存在表达差异。KEGG富集结果显示表达差异基因主要集中在核糖体、氧化磷酸化、内质网上蛋白加工过程、吞噬体和胞吞作用、蛋白输出、糖代谢途径和MAPK途径，其中富集到核糖体、氧化磷酸化和蛋白输出途径上的基因几乎全部都是表达下调，富集到糖代谢途径和MAPK途径上的基因基本都是表达上调。PheNetic网络分析得到一个只有转录因子-DNA一种互作关系的网络图，图中包括了75个基因和77个交互点，计算分析得出26个可能的性状诱发基因，并按照分值进行排序。
　　随机选取了20个基因进行荧光定量PCR，验证结果显示转录组测序数据的准确性达95％。同时还检测了高糖压力下两菌株的相对呼吸强度，检测结果也与转录组测序结果相符，突变菌株的相对呼吸强度只是野生菌株的74.2％。
　　根据PheNetic分析结果，选取排在前两位的诱发基因STE12和TUP1，在突变菌株UV02_HG的单倍体细胞中分别利用Cre/loxp系统进行单基因敲除，基因敲除后将MATa型和MATα型单倍体细胞复倍，利用pSH65质粒消除KanMX抗性。获得基因缺失菌株UV02_HGΔSTE12和UV02_HGΔTUP1。为了进一步研究两个基因对酿酒酵母细胞高糖耐受性的影响，利用BsmBI内切酶的酶切特点，一步法快速将TEF启动子、读码框和CYC1终止子连接到含有KanMX抗性的载体上，利用带有同源臂的引物扩增获得“TEF启动子-TUP1/STE12读码框-CYC1终止子-KanMX”序列，再次利用同源置换的方法在基因缺失菌株的单倍体细胞中分别将两个基因整合回补到原来的位置上，单倍体细胞复倍后获得基因回补菌株UV02_HGΔSTE12Hb和UV02_HGΔTUP1Hb。
　　对基因缺失菌株和基因回补菌株的性状变化进行检测，STE12基因缺失菌株UV02_HGΔSTE12在YPD培养基中前期生长速率比UV02_HG慢，12小时后生长速率超过了UV02_HG，在液体YP40培养基和高浓度葡萄糖的固体培养基平板上，耐受能力明显比UV02_HG提高，在YP40液体培养基中最大细胞数增加了24.2％，而乙醇产率没有明显变化，对乙醇耐受能力也没有明显变化。UV02_HGΔSTE12菌株细胞相对呼吸强度变弱，细胞膜透性降低。STE12基因回补后菌株在YPD培养基中的生长无明显变化，在YP40培养基中生长速率略微降低但乙醇发酵产率无显著变化。菌株UV02_HGΔSTE12Hb的相对呼吸强度略有提高，细胞膜对蛋白质的透性略有增强。PheNetic分析获得的网络图中被STE12影响的16个未知基因，GO富集显示这些蛋白都与高渗环境下细胞的细胞膜相关，它们通过疏水的跨膜蛋白与内质网膜或细胞质膜相互作用，综合以上结果，我们推测STE12转录因子主要是通过细胞膜对酿酒酵母细胞的高糖耐受性起作用，对细胞的乙醇代谢途径影响不大。
　　与菌株UV02_HG相比，TUP1基因缺失菌株UV02_HGΔTUP1在YPD培养基中生长受到明显抑制，生长速率和最大细胞数都低于UV02_HG菌株，平均最大细胞数只有UV02_HG菌株的87.7％。然而在高浓度葡萄糖培养基中的生长速率、乙醇产率都比UV02_HG菌株有所提高。细胞相对呼吸强度在YPD培养基和YP40培养基中变化显著，在YPD培养基中UV02_HGΔTUP1的相对呼吸强度不到UV02_HG菌株的20％，而在YP40培养基中增强到了90％。基因回补表达菌株UV02_HGΔTUP1Hb在YPD培养基中的生长有所恢复，相对呼吸强度也有明显提高，而在YP40中的生长和乙醇发酵产率都有所降低，在40％葡萄糖压力下细胞膜对核酸的透性降低。根据实验结果我们推测，TUP1基因对细胞呼吸的调控影响着细胞的正常生长，但在压力环境下，应激反应过程中，TUP1基因缺失后另有其他调控因子对细胞呼吸进行调控;另外TUP1基因还参与糖代谢和细胞透性的调控，尤其是对核酸的透性，基因缺失后对核酸的透性显著增强，基因回补表达后对核酸透性有所减弱。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 酿酒酵母糖发酵研究的发展史

1．2 绿色新能源-燃料乙醇

1．3 影响酿酒酵母乙醇发酵的因素

1．4 酿酒酵母耐高渗机制的研究

1．4．1 HOG途径上游信号转导机制

1．4．2 HOG途径下游适应性应答

1．5 基因表达量测定方法的发展

1．5．1 Northern印迹法

1．5．2 RT-PCR

1．5．3 微列阵芯片技术

1．5．4 RNA-Seq

1．6 酵母基因功能研究方法

1．7 立项依据和研究内容

1．8 技术路线

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 菌种培养与保存

2．1．4 酶与试剂

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．2 菌株在YPD培养基中生长曲线的测定

2．2．3 菌株在YP40培养基中生长曲线和发酵曲线的测定

2．2．4 菌株在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况

2．2．5 菌株乙醇耐受性的检测

2．2．6 RNA的提取及质量检测

2．2．7 转录组测序数据分析

2．2．8 荧光定量PCR检测

2．2．9 菌株相对呼吸强度的检测

2．2．10 高糖胁迫下细胞膜透性的检测

2．2．11 利用Cre／LoxP系统对STE12和TUP1基因进行敲除

2．2．12 敲除菌株性状变化检测

2．2．13 STE12和TUP1基因的回补表达

2．2．14 回补表达菌株性状的检测

第三章 结果与分析

3．1 紫外诱变菌株的筛选

3．3 菌株UV02_HG和MF02在YP40培养基中的生长和发酵曲线

3．4 菌株MF02和UV02_HG在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况

3．5 菌株MF02和UV02_HG乙醇耐受性的检测

3．6 RNA提取及质量检测

3．7 转录组测序及数据分析

3．7．1 测序数据质量分析

3．7．2 与参考基因组比对情况

3．7．3 表达差异分析

3．7．4 KEGG分析

3．7．5 GO分析

3．7．6 SNP分析

3．7．7 PheNetic网络分析

3．8 荧光定量PCR验证

3．9 高糖压力下突变株UV02_HG和野生菌株MF02相对呼吸强度的检测

3．10．高糖压力下突变菌株UV02_HG和野生菌株MF02细胞膜透性的变化

3．11．1 两个基因的扩增

3．11．2 敲除系统的构建

3．11．4 敲除株的筛选及验证

3．11．5 单倍体敲除株的复倍

3．11．6 二倍体敲除株的消抗

3．12 基因缺失菌株的性状检测

3．12．1 基因缺失菌株在YPD培养基中的生长曲线

3．12．2 基因缺失菌株在YP40中的生长和发酵曲线

3．12．3 基因缺失菌株在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况

3．12．4 基因缺失菌株乙醇耐受性的检测

3．12．5 基因缺失菌株相对呼吸强度的检测

3．12．6 基因缺失菌株在高糖压力下细胞膜透性的检测

3．13 STE12 TUP1基因的回补表达

3．13．2 表达组件的构建

3．13．3 同源置换片段的转化及筛选

3．14 回补菌株性状变化的检测

3．14．1 基因缺失和基因回补菌株在YPD中的生长曲线

3．14．2 基因缺失和基因回补菌株在YP40中的生长和发酵曲线

3．14．3 基因缺失和基因回补菌株相对呼吸强度的检测

3．14．4 基因缺失和基因回补菌株细胞膜透性的检测

第四章 讨论

4．1．3 糖代谢途径

4．1．4 MAPK途径

4．1．5 蛋白加工及运输

4．1．6 突变菌株性状诱发因子分析

4．2 STE12和TUP1基因对酿酒酵母菌株耐高糖性状的影响及功能分析

4．2．2 TUP1基因

第五章 总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果