限制性体位窒息死亡大鼠的膈肌研究

摘要

1.研究背景与目的： 近年来，由于限制性体位窒息案例的发生率猛增，已引起国内外法医学家们的极大关注，并且已被确认为亟待解决的法医学疑难课题之一。因为此种窒息表现缺乏口鼻部、颈部组织的损伤支持，故无法准确解释其死亡机制，也缺乏特异、敏感的形态学鉴定指标，往往引起鉴定结果的争议。 国内的陈玉川和我的导师竞花兰等学者进行了一系列研究，首先使用“限制性体位性窒息”来命名这种死亡方式，用于解释当事人处于一定的限制性体位下，经过一段时间后发生死亡的案件。姜富学、张宜俊等以家兔建立体位性窒息模型，通过血气分析、膈肌肌电改变、和形态学观察等手段对限制性引起死亡的机制进行了一系列探讨。本研究旨在前人对限制性体位窒息死亡的实验研究和案例报道的基础上，建立动物模型，探索膈肌的变化，继续研究在限制性体位下发生窒息死亡的机制，并提供新的证明手段。 2.材料与方法： 2.1实验动物与分组32只成年雄性Wister大鼠(由中山大学实验动物中心提供)，体重200±10g。将大鼠随机分成4组，每组8只，分别采用以下方法处理：Ⅰ组(对照组)直接断颈处死；Ⅱ组固定四肢1小时后断颈处死；Ⅲ组固定四肢并以400克重物压迫肩背部1小时后断颈处死；Ⅳ组固定四肢并以600克重物压迫肩背部直至大鼠死亡。 2.2体外膈肌收缩特性研究预先制作膈肌收缩张力体外测量装置，选择单刺激电压及测定最适前负荷。大鼠死亡后迅速取出约1cm宽的大鼠膈肌左前侧肌条，测量等长单收缩张力Pt，等长最大强直收缩张力P0和张力——频率关系。所得数据先用SPSS13.0建立数据库，输入各组数据，若方差齐，则实验结果采用One-way单因素方差分析；若方差不齐，则采用Kruskai-Wallis秩和检验。 2.3形态学观察大鼠死亡后，取膈肌一小块，用10％福尔马林液固定3天后，进行常规脱水、石蜡包埋、2μm切片，进行HE染色，镜下观察、显微照相。 2.4免疫荧光组织化学染色抗体采用兔抗鼠组织纤维连接蛋白(Fibronectin，Fn)和热休克蛋白70型(HeatShockProtein70，HSP70)。组织选用同HE染色。染色时Fn抗体用Cy3标记，显红色荧光，HSP70抗体用FITC标记，显黄绿色荧光。 2.5荧光显微镜观察、拍照和图像分析在低倍镜下找到膈肌细胞阳性产物后，调至100倍和400倍，随机选取拍照。阳性反应强度用图像处理系统灰度级表示，得到阳性膈肌细胞的平均灰度级后，将数据进行统计学分析，方法同前。 3.研究结果： 3.1实验组大鼠死亡过程中的表现实验组大鼠出现呼吸频率快、烦躁不安、挣扎、张嘴呼吸、口唇紫绀等表现，至死亡前出现反常呼吸，叹气样呼吸和膈肌痉挛表现。第Ⅰ组大鼠断颈后迅速死亡，第Ⅱ、Ⅲ组大鼠于60分钟时断颈处死，第Ⅳ组大鼠的死亡时间为97.5±28.9分钟。 3.2膈肌体外收缩特性检测结果第Ⅳ组大鼠的膈肌条均未引出收缩。Pt在Ⅰ-Ⅲ组间无差异(P＞0.05)；P0在Ⅰ和Ⅱ组间无差异(P＞0.05)，Ⅲ组的P0比Ⅰ和Ⅱ组显著减小(P＜0.05)。TPT与1/2RT也无组间差异(P＞0.05)。比较大鼠的膈肌条在不同频率的串刺激下产生的等长收缩张力曲线发现，第Ⅲ组大鼠的曲线较Ⅰ、Ⅱ组明显降低(P＜0.05)，Ⅰ、Ⅱ组之间的曲线无明显变化(P＞0.05)。 3.3HE染色观察结果限制性体位组大鼠膈肌中血管内可见大量红细胞淤积，部分膈肌细胞排列扭曲，肌纤维断裂，肌间隙增宽，肌细胞周围有红细胞散在分布。对照组中无明显改变。 3.4免疫荧光组织化学染色观察结果各组大鼠均有相应抗体的表达。对照组Fn荧光显示抗原主要分布于血管和血管周围基质，肌纤维仅有微弱的荧光。实验组中损伤的膈肌肌内膜上有明亮荧光，肌浆上的荧光弱，故荧光呈筛孔状分布。间质内的荧光围绕血管递减分布。随着膈肌损伤程度加重肌内膜上的荧光增强，呈网状或条索状，血管周围基质出现荧光堆积，肌纤维轮廓不清，肌纤维间排列重叠或疏松扭曲，其形态与HE染色所见肌纤维损伤一致。 HSP70抗体主要分布于肌纤维内，细胞核分布尤为明显。血管壁和红细胞也有明显分布。肌纤维间无明显分布。随着体位限制程度加重，肌纤维内的荧光强度明显增加，部分肌纤维内呈颗粒状聚集，分布较均匀，肌内膜和细胞间的分布也有增加，部分肌内膜上呈斑点、片状聚集。 Fn抗体的表达在Ⅲ、Ⅳ组之间无差异(P＞0.05)，其余各组间有明显差异(P＜0.05)。HSP70抗体表达在第Ⅰ、Ⅱ组间和在第Ⅲ、Ⅳ组之间差异无显著性意义(P＞0.05)，在其它组之间有显著差异(P＜0.05)。 4.讨论： 4.1研究膈肌损伤在限制性体位窒息中的意义和本实验的特点在研究对象的选取上，本实验专注于膈肌。窒息是限制性体位下发生死亡的重要原因，膈肌作为主要的呼吸肌，在这一过程中起了十分重要的作用。本实验的特点和创新性在于：采用公认的判断膈肌疲劳的方法——力学特性的变化，对膈肌存在疲劳直接加以证明；将免疫荧光手段结合组织化学，对膈肌细胞进行观察，实验手段更灵敏、直观，稳定性和可重复性大大提高。 4.2膈肌体外收缩特性呼吸肌是呼吸运动的主要动力，而膈肌是最重要的吸气肌。膈肌疲劳是指膈肌在负荷下活动而导致其产生力量和(或)速度的能力下降。膈肌疲劳与呼吸衰竭的发生和发展有密切关系。 本实验采用测量膈肌体外收缩特性的方法直接证明了在限制性体位下，大鼠的膈肌发生了疲劳。在动物实验中，膈肌疲劳的程度取决于呼吸运动受限制程度的大小和时间长短。当仅有限制体位，而没有外力压迫于背部时，膈肌张力和呼吸运动并无显著改变；当作用于背部的外力加大时，呼吸运动导致膈肌疲劳的速度大大加快了；当膈肌疲劳至无法收缩时，大鼠窒息死亡。在这一过程中最重要的是有无足够的力量限制了死者生前的呼吸运动，并且持续了足够长的时间。限制力量与时间不足的单纯限制体位并不足以导致肺通气功能障碍。 4.3Fn的免疫荧光染色Fn几乎分布在人体所有的部位，包括血浆和许多组织的细胞外基质中，这些细胞为成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞。组织损伤后的早期，Fn在伤口及其附近的浓度大大增加，这是由于伤口周围的血管对Fn的通透性增高，使血浆的Fn向伤口渗入以及受伤区域的内皮细胞、成纤维细胞大量合成、分泌这种糖蛋白的结果。本实验中Fn在各组间表达的差异体现了随着体位限制程度的增加而增加的规律，Fn在膈肌中的表达增强主要是由于膈肌细胞损伤造成的，证明膈肌的损伤在不同组别之间逐渐加重。Fn是一个反映细胞损伤程度的较为稳定的指标，有望在实际检验中进行应用。 检测Fn的表达也可以采用原位杂交方法的mRNA的表达，优点是具有较高的灵敏度和特异性，但受蛋白质表达时间的限制，该方法不适用于发生体位性窒息死亡的个体，且实验手段复杂，不适用于法医学日常检验。免疫荧光组织化学染色较传统的免疫组织化学手段更加灵敏，特异性更强，可以作为一个可靠的可重复手段进行应用。 4.4Hsp70的免疫荧光染色HSP又称应激蛋白，是所有原核细胞和真核细胞在高温或应激情况下所产生的一组具有高度保守性的蛋白质分子家族，许多生理、病理以及应激因素均可以诱导HSP产生。多数学者的研究认为，一次急性运动对HSP70的表达即有激活作用，能稳定增加HSP70mRNA的聚集，但仍不足以影响已经高基础水平的蛋白质。本实验中，对照组已有HSP70抗体明显分布，实验组中抗体改变较Fn迟，且组间差异小于Fn，但也随着限制程度的加重而呈增加趋势。与人体实验中HSP的出现时间相比较慢，损伤1小时的大鼠膈肌细胞上已有HSP70的明显表达增加，考虑原因为本实验模型对膈肌细胞造成的损伤较人体实验重，以及存在种属差异，这有待人体样本实验进一步证实。 5.结论： 5.1限制性体位可以导致大鼠的膈肌发生疲劳，该状态持续时会损伤膈肌细胞，最终造成收缩功能衰竭。膈肌的功能与胸腹部受限的程度和时间相关。在限制性体位下，膈肌和其它呼吸肌的疲劳导可以导致肺通气功能障碍，最终发生体位性窒息死亡。 5.2本实验结果显示Fn和HSP70可以作为评价膈肌损伤程度的参考指标进行应用，在判断限制性体位下的死因是否与窒息有关时，免疫荧光组织化学染色方法是一个较为灵敏，特异性强的方法。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1实验仪器、试剂、耗材

2.2动物模型制作

2.3膈肌体外收缩特性研究

2.4常规HE染色

2.5免疫荧光组织化学染色

第3章 结果

3.1实验组大鼠死亡过程中的表现

3.2膈肌体外收缩特性检测结果

3.3HE染色观察结果

3.4免疫荧光组织化学染色观察结果

第4章 讨论

4.1膈肌损伤在限制性体位窒息中的意义和本实验的特点

4.2膈肌体外收缩特性

4.3 Fn的免疫荧光组织化学染色

4.4 Hsp70的免疫荧光组织化学染色

结束语

参考文献

附图

致谢

原创性声明