端粒酶特异性核酶抑制A549肺癌细胞端粒酶活性的实验研究

摘要

端粒酶是含有RNA和蛋白质组分的核糖核蛋白。端粒酶RNA为端粒酶合成端粒重复序列提供了模板，端粒酶逆转录酶是端粒酶的催化亚基。端粒酶能以自身RNA为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端维持端粒长度从而维持染色体的稳定性。研究结果显示，端粒酶几乎在人类各种恶性肿瘤中均有不同程度的表达，总的表达率在85％～90％，而在正常人体细胞几乎不表达。由于染色体DNA末端复制问题，正常人体细胞每分裂一次，端粒就缩短50-200bp,当端粒的长度缩短到一定临界值后，染色体末端的稳定性被破坏，导致细胞死亡。肿瘤细胞中由于端粒酶的高表达维持端粒的长度使其获得无限增殖的能力。鉴于这一特性，端粒酶已被广泛地应用于肿瘤诊治的研究。 核酶(ribozyme)是具有酶的催化功能的RNA分子，核酶作为一种特异性抑制转录后基因表达的工具，已在基因治疗和后基因组研究领域显示出巨大的应用前景。目前主要集中在抗病毒、抗肿瘤的研究上。应用核酶技术来抑制端粒酶活性从而抑制肿瘤细胞的增殖不失为肿瘤基因治疗的一种有效方法。 本研究通过设计并合成针对人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA5’端区的锤头状核酶基因及针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的锤头状核酶基因，分别构建表达hTERT-RZ及hTR-RZ的重组质粒，脂质体介导法分别转染入人A549肺癌细胞株，用G418筛选出表达核酶的细胞克隆，观察比较两种核酶对人端粒酶活性的抑制效力。对端粒酶活性下降明显的细胞克隆进一步检测细胞增殖和凋亡的情况，一方面验证以端粒酶为靶点的抗癌治疗的可行性，为进一步应用于临床提供研究基础；另一方面为核酶用于肺癌的基因治疗提供了实验依据。 主要研究方法和结果： 1.分别设计并合成针对端粒酶hTERTmRNA5’端区的锤头状核酶基因及针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因，单链通过退火形成含EcoRI和SalI突出末端的寡核苷酸链，并将其分别连接到真核表达质粒pCIneo中构建了重组质粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ。通过酶切及测序鉴定证实插入载体pCIneo中的序列与设计的序列完全一致。 2.重组质粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ脂质体法分别转染A549肺癌细胞，以转染空质粒pCIneo的A549肺癌细胞作为阴性对照组，未经处理的A549肺癌细胞作为空白对照组。用G418做稳定筛选，筛选出阳性克隆扩增培养。每组均获得许多细胞克隆，随机挑取了转染pCIneo-hTERT-RZ重组体的6个细胞克隆(clonehTERT1～6)分别扩增培养，转染pCIneo-hTR-RZ重组体的6个细胞克隆(clonehTR1～6)分别扩增培养，转染pCIneo质粒的细胞克隆混合培养。 3.利用RT-PCR方法检测核酶的表达，结果clonehTERT1～6、clonehTR1～6均有核酶的表达。利用RT-PCR方法检测clonehTERT1～6、阴性对照组、空白对照组hTERTmRNA的表达水平，clonehTR1～6、阴性对照组、空白对照组hTR的表达水平。结果clonehTERT1～6hTERTmRNA的含量较空白对照组及阴性对照组明显下降，下降最明显的大约为空白对照组的12％，clonehTERT1～6hTERTmRNA的平均含量为空白对照组的30±19％；clonehTR1～6hTR含量较空白对照组及阴性对照组下降，下降最明显的大约为空白对照组的32％,clonehTR1～6hTR的平均含量为空白对照组的49±17％。用TRAP法测定clonehTERT1～6、clonehTR(1、3、5)、阴性对照组、空白对照组的端粒酶活性。结果阴性对照组端粒酶活性较空白对照组无明显改变；clonehTERT1～6端粒酶活性均下降，其平均端粒酶活性是空白对照组的27±18％，且与hTERTmRNA的表达水平一致，clonehTERT1的活性下降最明显，约为空白对照组的11％；clonehTR(1、3、5)端粒酶活性也下降，其平均端粒酶活性是空白对照组的36±13％,clonehTR3活性下降最明显，约为空白对照组的22％。MTT法测定clonehTERT1、clonehTR3、阴性对照组、空白对照组的细胞生长曲线，clonehTERT1、clonehTR3生长较空白对照组及阴性对照组减缓，而clonehTERT1又较clonehTR3生长慢。Hochest33342染色法、流式细胞仪检测均证实clonehTERT1(21.5％)、clonehTR3(16.1％)凋亡率比空白对照组(2.1％)及阴性对照组(5.2％)显著增高。clonehTERT1凋亡率又比clonehTR3的凋亡率高。 结论： 1.分别设计并合成针对端粒酶hTERTmRNA5’端区的锤头状核酶基因及针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因，构建了两个锤头状核酶表达重组质粒。 2.构建的核酶表达载体稳定转染A549细胞后得到的细胞克隆，均可以检测到核酶的表达。 3.稳定转染核酶重组体的细胞的端粒酶活性被抑制，细胞的生长与增殖变慢，凋亡率增加。 4.实验结果显示两种核酶对细胞端粒酶活性和细胞增殖的抑制效力不同，针对端粒酶bTERTmRNA5端区的锤头状核酶比针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶抑制效果更强；促进细胞凋亡的程度不同，针对端粒酶hTERTmRNA5’端区的锤头状核酶比针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶更容易促进细胞凋亡。说明端粒酶hTERTmRNA可能是比端粒酶RNA更为理想的端粒酶抑制剂的靶点。

目录

文摘

英文文摘

引 言

第1章端粒酶特异性核酶表达载体的构建与鉴定

第2章端粒酶特异性核酶表达载体稳定转染人A549肺癌细胞株

第3章端粒酶特异性核酶对A549肺癌细胞株端粒酶活性、增殖及凋亡的影响

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

原创性声明