重组人Kringle 5和溶血磷脂酸（LPA）在眼表炎症性疾病中的作用

摘要

眼表疾病是一组临床常见病，其中角膜新生血管(Comeal neovascularization,CNV)是各种致病因素所引起的严重眼表并发症，是最常见、治疗最棘手的致盲性眼病之一。不但严重影响视力，而且也是同种异体角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。至今，CNV的发病机理尚未明确，治疗上也没有理想的方法。因此，人们一直在研究角膜新生血管生成的发病机制和能阻止角膜新生血管生成的抑制剂。近年来，随着对肿瘤和眼部新生血管的深入研究，在角膜新生血管抑制剂方面的研究已取得了迅猛发展，发现了许多角膜新生血管形成抑制剂。Kringle5(K5蛋白)是一种新型有效的血管生成抑制因子，是血浆纤溶酶原的一种蛋白水解片段，由约80个氨基酸残基组成。体外细胞培养显示，K5蛋白可以明显抑制人血管内皮细胞的增殖和移行，诱导增殖中的内皮细胞凋亡或引起细胞周期停滞，其抑制效果是血管生成抑制素的50倍。在正常氧及低氧条件下，重组人K5蛋白对人原代视网膜毛细血管内皮细胞增殖呈现一种剂量依赖性的抑制作用；玻璃体腔内注射K5蛋白可预防或阻滞缺血性视网膜新生血管的进展。但其对CNV的作用及其机制国内外尚未见报道。因此，本研究首次将重组人K5蛋白配成不同浓度的滴眼液，用于碱烧伤诱导的兔角膜新生血管模型，采用裂隙灯显微镜、组织病理学检查观察其对CNV的抑制情况。 近年来，分子水平的研究已取得较大进展，认为血管生成抑制因子与刺激因子所产生的生物网络平衡在调节血管生成中起重要作用。角膜新生血管的形成不仅要求上调新生血管刺激因子(如：血管内皮细胞生长因子(VEGF))，而且同时下调新生血管抑制因子(如：血管生成抑制素)。内源性的新生血管抑制剂对于维持角膜的无血管状态起着尤其重要的作用。在有些病理状态下，如角膜移植或化学损伤，角膜的某些部位可提高新生血管刺激因子的产生，并降低新生血管抑制因子的产生，从而打破了新生血管的平衡，导致毛细血管内皮细胞过度增殖，最终引起NV。已发现一些与眼部NV有关的刺激因子和抑制因子。VEGF是高度选择性的血管内皮细胞有丝分裂原，可调节血管渗透性(血管渗透因子)，在炎症性小鼠CNV中起重要的作用。 NV的形成是一个复杂的过程，包括内皮细胞的增殖，迁移，基底膜的降解，和血管腔的形成。在局部生长因子的控制下，微血管内皮细胞的增生是NV形成的关键步骤，为研究K5蛋白抗CNV的分子机制，我们将K5蛋白用于原代培养的新生小牛胸主动脉血管内皮细胞(BAEC)，新生小牛胸主动脉血管成纤维细胞(BAFC)，血管平滑肌细胞(VSMC)，检测K5蛋白对细胞增殖的影响，并采用流式细胞仪检测K5对细胞周期的影响，同时我们还采用电子显微镜检查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在体和离体检测K5对BAEC凋亡的影响，从结构上深入研究K5的作用机制。 炎症反应贯穿眼表面疾病的整个过程，是常见的病理现象。溶血磷脂酸(LPA)是一重要的脂质介质，它通过激活G蛋白偶联受体产生广泛的生物学作用，其作用可分为生长相关的(如：增殖，抗凋亡)和细胞骨架相关的(如：集合，粘付，收缩，分泌，趋化性)。LPA也参与一些生理病理过程如炎症反应。LPA参与中性粒细胞的运动，极化，及新陈代谢，并且可诱导人类单核细胞的迁移。研究发现一些脂源性介质，如血小板激活因子(PAF)，涉及眼部免疫和炎症反应的启动，延续和维持，但是，LPA的生理作用及其受体在眼表炎症中的作用尚不明确。 在本研究中，我们假设LPA在人角膜上皮细胞中充当炎症介质的角色。利用已建立的细胞株作为模型系统，检测LPA的产生，LPA及炎症因子的信号反应，及LPA受体拮抗剂的作用。另外，我们还着重研究K5蛋白与LPA在眼表面炎症反应中的关系。我们检测K5蛋白对LPA的产生，LPA诱导的细胞增殖，及LPA诱导的与细胞增殖和炎症有关的信号转导途径的影响。 论文主要包括以下三个部分： 第1章重组人Kringle 5(K5蛋白)滴眼液对碱烧伤 诱导的兔角膜新生血管的治疗作用及机制 1.1 重组人K5蛋白滴眼液对角膜新生血管的作用 1.1.1碱烧伤诱导的单眼角膜新生血管(CNV)动物模型的建立 碱烧伤后角膜中央迅速出现一边界清楚的浑浊区，PBS冲洗后浑浊加重，变为瓷白色。伤后72小时角膜缘新生血管芽长入角膜，并向中央移行；第2周新生血管生长旺盛，长入烧灼斑：第3周，达角膜中央区；第28天血管布满整个角膜。HE染色可见新生血管自角膜缘长入烧伤区，伴大量炎性细胞浸润。 1.1.2 K5蛋白滴眼液对CNV的抑制作用 K5蛋白滴眼液对CNV的抑制作用表现在10和20mg/L治疗组延迟了CNV的出现时间并降低了CNV的长度和面积，而5mg/L组则无明显变化。这些结果表示K5蛋白对CNV的抑制作用呈剂量依赖性。 1.1.3 K5蛋白滴眼液对CNV退化的作用 在我们的动物模型中，伤后2周CNV形成，此时应用K5蛋白滴眼液可明显促进CNV的退化。 1.1.4 K5蛋白滴眼液的抗炎症作用 Wilcoxon秩和检验发现，在各个时间点上，10和20mg/L K5治疗组炎症指数均明显低于对照组(P均＜0.001)，而10和20mg/L K5治疗组组间比较差异无显著意义(P值均＞0.05)。5mg/L组与对照组比较，差异无显著意义(P＞0.05)，但与10和20mg/L组相比，差异有显著意义(P值均＜0.05)。这些结果提示K5有抗炎症作用，且呈剂量依赖性。 组织学检查发现10和20mg/L组角膜炎症细胞浸润均明显低于5mg/L组与对照组。角膜后膜，一种炎性膜，可在5mg/L组与对照组中观察到，而在10和20mg/L组则无。组织学研究进一步明确了K5在本模型中的抗炎作用。 1.1.5 兔角膜NV面积与角膜后膜及炎性细胞的相关性 伤后28天各组兔角膜后膜(层数)、炎性细胞数分别与角膜NV面积Pearson等级相关分析显示，各组角膜NV面积与角膜后膜(层数)及炎性细胞数呈正相关。 1.2 K5蛋白抑制角膜新生血管的机制研究 采用免疫组织化学和Western blot方法检测K5蛋白对角膜组织中VEGF表达水平的影响。原代培养了BAEC，BAFC，VSMC，利用MTT检测K5蛋白对细胞增殖的影响，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，同时我们还采用电子显微镜检查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在体和离体检测K5蛋白对BAEC凋亡的影响。 1.2.1 K5蛋白下调角膜VEGF的表达 5mg/L K5组与对照组中可见VEGF在角膜上皮细胞、角膜细胞、内皮细胞、增殖的角膜基质纤维及CNV壁的某些细胞(如：周细胞和单核细胞)上均呈强阳性表达，还在大量的炎性细胞的胞浆中有强阳性表达。10和20 mg／L K5组可见VEGF在上述部位均有弱阳性表达。 采用免疫沉淀的方法将K5对VEGF表达的作用进行半定量分析，与免疫组织化学的结果相同，与PBS对照组相比，20mg／L K5滴眼液可降低角膜VEGF的水平5倍(P<0.01)，提示K5可降低碱烧伤后角膜中VEGF的表达。 1.2.2 K5蛋白特异性抑制BAEC的生长 K5蛋白可以剂量和时间依赖的方式抑制BAEC细胞增殖，而对BVSMC或BAFC无作用，提示K5特异性抑制内皮细胞的作用。 1.2.3 K5蛋白对BAEC细胞周期的影响 K5蛋白明显抑制BAEC S期细胞百分比和G2+S／G<,1>，使BAEC在G<,1>期发生细胞周期停滞。 1.2.4 K5蛋白对BAEC细胞超微结构的影响 80nM K5蛋白明显改变了内皮细胞的形态，K5治疗组的细胞呈球形且具有一些细胞核及细胞质的异常。细胞核浓缩是细胞凋亡的一个典型特征，染色质浓缩出现于细胞核内或细胞核周边。同时可观察到不同形态的异常空泡，其周围含有细胞碎片，K5治疗组的细胞内还可看到凋亡小体，进一步证明K5可诱导内皮细胞的凋亡。 1.2.5 K5蛋白诱导内皮细胞凋亡 琼脂糖凝胶电泳分析发现，80nM K5可引起典型的DNA碎片(250-bp至300-bp多倍体)，相反，在对照组和20nM，40nM K5组均未见，DNA碎片。TUNEL检测结果表明，与对照组比较，20mg／L K5提高了CNV的凋亡内皮细胞数。 第2章 溶血磷脂酸(LPA)在眼表炎症中的作用 在本研究中，我们假设LPA在人角膜上皮细胞中充当炎症介质的角色。利用已建立的细胞株作为模型系统，检测LPA的产生，LPA及炎症因子的信号反应，及LPA受体拮抗剂的作用。 2.1 2.040 pRSV-T角膜上皮细胞产生LPA及不同介质对LPA产生的影响 2.2 LPS对LPA产生的作用 2.4 LPA和炎症因子在2.040 pRSV-T细胞信号转导中的作用 第3章溶血磷脂酸(LPA)与K5蛋白在眼表炎症反应中的关系 K5蛋白可抑制：1)外源性LPA／或LPS诱导的2.040 pRSV-T角膜上皮细胞分泌产生的LPA水平；2)外源性LPA诱导的2.040 pRSV-T角膜上皮细胞增殖；3)外源性LPA诱导的Erk和p38的磷酸化。

目录

文摘

英文文摘

引言

第1章重组人Kringle 5(K5蛋白)滴眼液对碱烧伤诱导的兔角膜新生血管的治疗作用及机制

1.1重组人K5蛋白滴眼液对角膜新生血管的作用

1.2重组人K5蛋白抑制角膜新生血管的机制研究

第2章溶血磷脂酸（LPA）在眼表炎症中的作用

第3章溶血磷脂酸（LPA）与K5蛋白在眼表炎症反应中的关系

全文小结

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