红鳍东方鲀白细胞介素（IL）-15及其受体亚基同源基因的克隆鉴定和功能研究

摘要

高等脊椎动物中，细胞因子及其受体介导的信号系统对免疫调节和维持免疫系统的动态平衡起着重要作用。其中包括白细胞介素(interleukin.IL)-2、IL-7和IL-15在内的IL-2家族成员，是调控免疫细胞分化、生长发育、活化增殖的关键因子。目前的研究阐明硬骨鱼类的免疫细胞组成与哺乳类动物相似，因此，与鱼类免疫细胞分化、生长发育和活化调节相关的鱼类细胞因子正成为鱼类免疫学的研究热点。但由于白细胞介素等细胞因子在趋异进化过程中的变异程度非常高，增加了鱼类相关基因的开发难度，以致于相关的研究滞后。在本文中，作者充分利用基因组数据库资源和生物信息学方法，并结合分子生物学技术，开发红鳍东方纯(Takifugu rubripes)lL-15的两种同源基因和受体亚基基因，并进行重组蛋白的表达及其功能研究。包括以下几个研究内容： 1．利用电子克隆技术(in sillco cloning)和RACE(cDNA末端快速扩增)方法，率先克隆并鉴定了两种不同的红鳍东方鲀IL-15同源基因：IL-15和IL-15L。与高等脊椎动物IL-15基因相比，两种IL-15同源基因编码的蛋白不仅都有较高的序列相似性，而且都拥有4个α螺旋结构和4个保守的半胱氨酸残基以及一段很长的信号肽；两种IL-15同源基因同样广泛表达于各个组织。红鳍东方鲀IL-15还在基因结构和基因同线性保守关系上与哺乳类IL-15相同，两者是直向同源基因。但IL-15L在序列、基因结构、同线性结构以及基因的表达模式上却区别于IL-15。斑马鱼(Danio rerio)和黑青斑河鲀(Teteraodon nigroviridis)IL-15和lL-15L的克隆和鉴定，进一步说明鱼类存在两种不同的IL-15同源基因。此外，重组红鳍东方鲀IL-15和IL-15L蛋白能活化外周白细胞，也说明了鱼类IL-15和IL-15L基因表达产物与高等脊椎动物同源基因一样，是维持免疫细胞生长和增殖的重要因子。 2．本文还利用电子克隆和RACE方法，克隆并鉴定了红鳍东方鲀IL-15的两个受体亚基同源基因：Yc和IL-15Rα。红鳍东方鲀Yc在蛋白序列相似性、蛋白结构、基因结构、基因同线性关系以及基因广泛表达于许多组织的模式等方面都具有哺乳类同源基因的特征；而红鳍东方鲀IL-15Rα亚基拥有与哺乳类IL-15Rα基因相似的基因结构、保守蛋白结构域和相似的基因表达模式，并且鱼类和哺乳类的IL-15Rα基因及其旁侧基因具有保守的同线性关系；这些证据说明红鳍东方鲀Yc和IL-15Rα分别是哺乳类Yc和IL-15Ra的直向同源基因。 3．本文构建了重组红鳍东方鲀IL-15Ra的逆转录病毒载体，并通过高效的病毒包装系统(PLAT-E)，成功筛选得到一株稳定表达重组红鳍东方鲀IL-15Ra膜蛋白的哺乳动物细胞株FL-15Rα-NRK。另外，通过细胞免疫大鼠，制备了能特异识别重组IL-15Ra膜蛋白的单克隆抗体2E6；并以2E6通过免疫共沉淀分离得到重组IL-15Rα蛋白；去糖基化实验说明重组红鳍东方鲀IL-15Rα蛋白被高度糖基化。 4．本文同样利用逆转录病毒表达系统，构建了另一株稳定表达红鳍东方纯IL-15Rα基因的细胞系15Rα-NRK，并初步分析了重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白分别与IL-15Rα之间的结合情况。结果显示：单独的红鳍东方鲀IL-15Rα亚基能与配体IL-2结合，但未能与IL-15或IL-15L结合，说明鱼类可能利用不同于哺乳类的细胞因子受体系统介导信号转导。 5．为了进一步研究红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白理化特征和生理活性，本文利用酵母表达系统建立了重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白诱导表达及纯化系统。其基本流程是：以BMGY培养阳性菌株克隆作为种子菌，然后以BMMY培养诱导；适当时间后收集培养上清，以镍离子亲和柱回收重组蛋白并进行脱盐处理。糖苷酶处理各重组蛋白后，发现它们均存在N-糖基化修饰，说明重组红鳍东方纯IL-2、IL-15和IL-15L蛋白是糖蛋白。重组IL-15和IL-15L蛋白均能活化CTLL-2细胞，说明红鳍东方鲀IL-15和IL-15L均具有哺乳类IL-15相同的功能；而IL-2未能维持CTLL-2细胞的生长，说明其与哺乳类IL-2在结构和功能上存在差异。另一方面，将重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白分别与黑青斑河鲀头肾细胞和斜带石斑鱼胸腺细胞孵育，发现细胞均能被活化和增殖，说明重组蛋白具有活化免疫细胞的生物学功能，有望应用于实际生产中，提高鱼体免疫力。

目录

文摘

英文文摘

第1 章 绪论

1 白细胞介素及其受体

1.1 IL-2及其受体

1.2 IL-15及其受体

1.3 Yc受体亚基

2 鱼类免疫细胞

2.1 非特异性毒性细胞和NK细胞

2.2 鱼类B、T淋巴细胞及其发生

3 鱼类细胞因子的基因克隆

3.1 同源比对

3.2 同线性分析

4 鱼类基因组数据库现状

4.1 斑马鱼

4.2 青鳉

4.3 红鳍东方鲀

4.4 黑青斑河鲀

4.5 其它种类

5 研究的主要目的和意义

5.1 研究目的

5.2 研究意义

6 创新点

附表

第2 章鱼类白细胞介素-15 同源基因的克隆及其功能鉴定

1 前言

2 材料和方法

2.1 IL-15同源基因克隆和鉴定

2.2 重组红鳍东方鱼鲀IL-15同源基因在真核系统的表达及活性分析

3 结果

3.1 鱼类两种IL-15 cDNA的克隆及序列分析

3.2 基因组分析

3.3 表达模式分析

3.4 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L基因在真核系统中的表达

3.5 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L蛋白的活化能力分析

4 讨 论

附图表

第3章：红鳍东方鲀白细胞介素-15受体亚基基因的克隆及其序列分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 候选基因的确定

2.2 红鳍东方鲀Yc同源基因的克隆

2.3 红鳍东方鲀IL-15Ra同源基因的克隆

2.4 序列分析

2.5 基因组分析

2.6 表达模式分析

3 结果

3.1 红鳍东方鲀Yc的克隆及其序列分析

3.2 红鳍东方鲀Yc基因结构及其保守同线性

3.3 红鳍东方鲀Yc基因的组织表达分析

3.4 红鳍东方鲀IL-15Ra的克隆及其序列分析

3.5 红鳍东方鲀IL-15Ra基因结构及其保守同线性

3.6 红鳍东方鲀IL-15Ra基因的表达分析

4 讨论

附图表

第4章：表达重组红鳍东方鲀IL-15Ra细胞系的建立及单克隆抗体制备

1 前言

2 材料和方法

2.1 表达重组红鳍东方鲀IL-15Ra稳定细胞株的建立

2.2 重组红鳍东方鲀IL-15Ra单克隆抗体的制备

2.3 免疫共沉淀分离化重组IL-15Ra蛋白及其糖基化分析

3 结果

3.1 重组红鳍东方鲀IL-15Ra逆转录病毒表达质粒的构建

3.2 重组红鳍东方鲀IL-15Ra以膜结合形式稳定表达于哺乳类细胞

3.3 重组红鳍东方鲀IL-15Ra单克隆抗体的制备

3.4 重组红鳍东方鲀IL-15Ra为高度糖基化蛋白

4 讨论

附图

第5 章: 红鳍东方鲀IL-15Ra与配体结合能力分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验设计

2.2 重组红鳍东方鲀IL-15Ra稳定细胞系的构建

2.3 流式细胞术检测配体受体结合情况

3 结果

3.1重组红鳍东方鲀IL-15Ra以膜蛋白形成表达于15Ra-NRK

3.2重组红鳍东方鲀IL-15Ra与各细胞因子的结合情况

4 讨论

附图

第6章:红鳍东方鲀IL-2、IL-15和IL-15L在毕氏酵母中的表达、纯化及其功能分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15以及IL-15L酵母表达载体的构建

2.2 酵母重组子的筛选鉴定

2.3 重组蛋白的表达条件优化

2.4 重组蛋白的纯化

2.5 重组蛋白糖基化修饰分析

2.6 重组蛋白的活性检测

3 结果

3.1 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15以及IL-15L酵母表达载体的构建

3.2 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15以及IL-15L酵母重组子的筛选鉴定

3.3 重组蛋白表达条件优化

3.4 重组蛋白的纯化

3.5 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15以及IL-15L蛋白的糖基化修饰分析

3.6 重组红鳍东方鲀IL-2、IL-15以及IL-15L蛋白的活性检测

4 讨论

附图表

总结与展望

参考文献

附录

致谢

论文原创性声明