基因芯片检测HBV全基因组转染HepG2细胞株早期基因的表达

摘要

研究背景:
　　 由乙型肝炎病毒(HBV)导致的乙型肝炎是严重危害人类健康的传染病，可引起肝硬化、肝癌、终末期肝病等严重并发症。目前全世界HBV感染者超过3.5亿人，我国是HBV感染高发区，现症的CHB患者为2000-3000万人。干扰素和核苷类似物用于乙肝治疗取得了一定效果，但存在诸多不足之处，如价格昂贵，疗效并不理想，需要长期用药，药物耐药逐年增长。而新药的开发受制于基础研究方面的不足，目前对病毒的生物学过程和宿主的病理学效应仍存在许多未知之处。
　　 对病毒感染和宿主反应的研究应从最基础的水平起步。从HBV侵入人体开始，机体的整个组织细胞-免疫网络-效应分子-免疫效应细胞等多个成分进入了一个整体信号协同的过程，涉及到的分子生物学机理十分复杂。在诸多的研究方法和工具中，采用高通量的基因芯片技术来探索病毒和宿主细胞之间庞大的信号网络具有重要的意义。目前有关HBV感染的基因芯片研究主要包括HBV的不同蛋白成分对宿主细胞的影响、药物治疗及HBV感染的并发症方面，大多数研究结果存在分歧。由于HBV本身的异质性、感染宿主的差异性和病理机制的复杂性，尤其是HBV作为一个整体侵入宿主细胞，不仅病毒自身各部分互相影响协调，宿主细胞更是多个复杂信号分子网络的整体，因此上述研究是远远不够的。目前有关HBV全基因组影响细胞基因表达的生物芯片研究甚少。我们采用Affy Human U1332.0A表达谱芯片研究HBV全基因组转染的HepG2细胞株，该芯片包含了真核细胞的50000个基因，是完成本课题的有力保障。
　　 研究目的:
　　 1观察HBV全基因组瞬时转染HepG2细胞株2952的基因表达谱变化，研究HBV急性期感染对宿主细胞的影响，探索HBV感染的发病机制。
　　 2进一步研究目前HBV感染的先天免疫发病机制中的两大热点-Toll样受体信号途径及NK细胞介导的信号途径，包括部分信号分子在多个细胞株的表达，探讨与HBV感染的关系。
　　 材料:
　　 采用本室构建的HBV全基因组质粒：pBlueScript-2952经摇菌抽提质粒后，Lgu I酶切回收3.2kbHBV DNA片断，转染HepG2细胞，分别检测细胞HBV RNA的表达，培养上清和细胞内HBeAg、HBsAg的分泌。Trizol收集细胞并抽提总RNA行基因芯片检测，对结果行生物信息学分析，包括上调和下调基因分类，基因功能分类，信号通路分析等等。实时定量聚合酶链反应( RT-PCR)验证部分基因在多个细胞株的表达。
　　 方法:
　　 1制备HBV全基因组质粒：引物设计，HBV全基因组扩增的PCR程序，PCR产物的纯化，PCR产物的克隆，连接SK-载体，转化感受态细胞及阳性克隆的筛选等方法见本课题既往研究。抽提质粒后酶切回收纯化HBV DNA。
　　 2 HBV全基因组的转染采用Lipofectamine2000转染HepG2细胞，转染48小时后收集细胞备用。
　　 3免疫组化及IMX法检测HBV抗原表达，原位杂交及实时定量PCR(RT-PCR)检测HBV mRNA表达。
　　 4基因芯片检测：提取和纯化细胞总RNA，分别合成和纯化cDNA、cRNA，cRNA片段化，配制杂交液芯片杂交，洗脱芯片，扫描芯片及数据分析。
　　 5实时定量PCR验证基因：设计引物，转染细胞收集提取总RNA，逆转录后行两步法定量PCR。研究抑癌基因Lumican、NK细胞的激活性受体KLC、抑制性受体KIR在HBV急性感染2952细胞株，HBV阴性的HepG2、7402、MHCC97-H细胞株，HBeAg阳性的HepG2.2.15细胞株，HBsAg阳性的Alexander细胞株的表达。
　　 结果:
　　 1成功转染HBV全基因组，免疫组化和IMX检测到HBV抗原分泌，细胞表达HBV RNA，表明HBV全基因组转染成功并在细胞复制翻译。
　　 2基因芯片结果显示瞬时转染细胞株2952与空白转染组HepG2细胞株比较，表现为143个基因(0.286％)的显著性改变，包括77个基因显示上调，66个基因下调，以早期的炎症因子和趋化因子表达上调最明显，癌基因和抑癌基因的表达在早期不占主要。Toll受体信号途径中的TLR4、IL-6、IL-8及干扰素诱导因子等表达上调；NK细胞激活性受体KLC和抑制性受体KIR均有激活，但KLC配体维甲酸受体应答元件1基因表达下调。本课题既往已对TLR4信号途径作了部分研究，故进一步研究选择了NK细胞杀伤信号途径中的两个受体和参与病理性纤维化的抑癌基因Lumican。
　　 32952细胞株表达的抑制性受体(KIR)为KIR3DL3，激活后使磷酸酶SHP和结合蛋白Vav等去磷酸化，该受体在e抗原阳性的急慢性HBV感染HepG2细胞株较e抗原阴性的慢性HBV感染Alexander细胞株明显上调；激活性受体为KLRC2(Killer cell lectin-like receptor subfamily C，member2,又名NKG2C)，在表面抗原阳性的急性HBV感染2952细胞株和慢性HBV感染Alexander细胞株均表达上调。
　　 4抑癌基因Lumican在2952细胞株表达上调，但在慢性HBV感染的HepG2.2.15、Alexander细胞株则表达下调。
　　 5 Lumican、KIR、KLC三个基因在高侵袭性的MHCC97-H细胞株均无明显表达。
　　 结论:
　　 1在HBV感染宿主细胞的急性期阶段，主要表现为细胞抗感染反应的激活，以炎症因子、干扰素、趋化因子等的表达为主。先天免疫中的TLR家族信号途径和NK细胞介导的杀伤信号途径显著改变。
　　 2 KLC、KIR和抑癌基因在HBV急慢性感染及HBV阴性细胞株的不同表达体现了HBV的免疫逃避机制和致癌机理。HBeAg可能通过上调抑制性受体避免NK细胞样的杀伤。
　　 3肝癌细胞株不仅表达NK细胞激活性受体的配体，也表达免疫细胞本身的受体，并受到HBV感染的影响，该基因是否在蛋白水平和体内的肝实质细胞有表达及表达的意义如何值得进一步研究。
　　 4 Lumican作为抑癌基因不仅影响肿瘤的生成，也可抑制胶原纤维被胶原酶降解。在HBV瞬时转染后该基因表达上调，慢性感染则表达不明显，提示在HBV导致的早期纤维化病变中以及肝脏癌变中可能具有一定作用，但目前尚无研究。
　　 5 Lumican、KLC基因在高侵袭性的MHCC97-H细胞株表达均不明显，可能与该肿瘤株恶性程度高有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要英文缩略词表

声明

前言

第一部分 基因芯片检测HBV转染后细胞早期基因变化

第一章 瞬时转染HBV全基因组HepG2细胞株的制备

第二章 基因芯片检测HBV全基因组转染细胞

第二部分 RT-PCR验证基因芯片结果

第三部分结果

讨论

参考文献

结论

展望

致谢