一种新的凡纳滨对虾血蓝蛋白内含子滞留选择性剪切体cHE1的克隆及其mRNA表达的研究

摘要

近期研究发现,无脊椎动物免疫分子与特异性免疫分子相似,同样具有分子多态性,其中选择性剪切是形成其分子多态性的一种重要的分子机制。存在于对虾等无脊椎动物血淋巴中的血蓝蛋白是近年发现的一种具有酚氧化酶活性,凝集活性,抑菌活性和抗病毒活性等多种免疫学活性的多功能蛋白。有意思的是,课题组前期研究发现对虾血蓝蛋白具有单核苷酸多态性(SNPs),尤其值得一提的是,最近本室意外发现对虾血蓝蛋白在mRNA水平可能同样存在选择性剪切。为此,本研究采取RT-PCR,实时定量PCR,生物信息学分析等方法,对血蓝蛋白中可能存在的选择性剪切体进行了积极的探索,所获研究结果具体如下:
　　1、选择性剪切体cHE1的克隆
　　RT-PCR结果显示,在对虾心脏组织中可检测到一种血蓝蛋白73kDa亚基的选择性剪切体cHE1(cDNA1 of hemocyanin,cHE1),其序列全长为2580bp,与对虾血蓝蛋白DNA序列完全一致,在其N末端和C末端分别存在1个内含子滞留序列,序列大小分别为296bp和268bp。而已知正常血蓝蛋白cHE(cDNA of hemocyanin,cHE)的序列全长约为2016bp,编码663个氨基酸。在此基础之上,进一步对其序列进行了生物信息学分析,结果表明两段滞留的内含子均位于信号肽及铜离子结合区之外,N末端的内含子编码了终止子,因而推测剪切体cHE1只编码一段26个氨基酸的多肽,而不编码血蓝蛋白活性蛋白。
　　2、选择性剪切体cHE1的时空表达分析
　　为了进一步了解cHE1mRNA表达情况,继而选择不同发育阶段的对虾及成虾不同组织进行特异性表达分析。结果发现,cHE1在凡纳滨对虾的不同发育阶段包括无节幼虾、糠虾幼体、鳋状幼体、仔虾和成虾中均可表达;在心脏、肌肉、鳃、胃、肠和脑中表达明显,而在肝胰脏和淋巴中没有检测到cHE1的表达。
　　3、病原胁迫对cHE1 mRNA表达水平的影响
　　为了探索cHE1在对虾免疫防御中的地位,在上述研究的基础之上,选用副溶血弧菌、乙型溶血链球菌及类病毒poly I:C等3种病原感染对虾,检测病原胁迫后cHE1 mRNA表达水平的变化。结果显示,病原菌胁迫可刺激cHE1在对虾心脏组织中的表达显著上调,在对虾感染副溶血弧菌、乙型溶血链球菌及类病毒poly I:C后12、9、12h后,cHE1的表达量达到最高,其表达量分别为未注射时的16、13和3.3倍。同时,cHE1 mRNA与cHE mRNA的表达变化呈现一定的负相关关系。这些研究结果暗示cHE1虽然不能翻译成有活性的蛋白,但其可能参与对虾免疫基因的表达调控,从而与cHE一同在对虾免疫防御中共同发挥抗感染免疫功能。
　　所获研究结果对揭示对虾血蓝蛋白的分子多态性,阐明血蓝蛋白功能多样性的分子机制等具有重要理论价值,为寻找一条新的对虾生态学防治策略奠定了良好的基础。

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第一章 前言

1.1 无脊椎动物免疫分子多态性及其形成机制研究进展

1.2 选择性剪切体研究进展

1.3 无脊椎动物免疫分子选择性剪切研究进展

1.4 血蓝蛋白功能研究功能及分子多态性研究进展

1.5 本论文研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 选择性剪切体cHE1的克隆

2.2 选择性剪切体cHE1的生物信息学分析

2.3 选择性剪切体cHE1 mRNA时空表达特异性分析

2.4 病原胁迫对cHE1 mRNA表达水平的影响

第三章 结果与分析

3.1 凡纳滨对虾73kDa亚基HE基因选择性剪切体cHE1的克隆

3.2 cHE1 生物信息学分析

3.3 凡纳滨对虾73kDa亚基cHE1 mRNA时空表达分析

3.5 采用荧光定量PCR技术检测病原胁迫对cHE1 mRNA表达水平的影响

3.6 高浓度病原胁迫对cHE1 mRNA表达水平的影响

3.7 病原胁迫实验cHE1表达量变化趋势分析

第四章 讨论

4.1 cHE1是一种新的内含子滞留选择型剪切体

4.2 cHE1在对虾免疫防御中可能发挥重要的免疫学功能

结论

参考文献

致谢

在读硕士期间发表的论文