雷帕霉素通过抑制mTOR信号增强SIRT1-LXRα-CCR7信号促进新西兰大白兔动脉粥样硬化斑块的消退

摘要

目的：
　　探讨哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白mTOR（mammalian target of rapamycin）的特异性抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）对动脉粥样硬化是否存在逆转效应；探究mTOR信号与SIRT1（沉默信息调节因子1）信号之间的调控关系；证实雷帕霉素可部分通过抑制mTOR信号进而增强SIRT1-LXR-CCR7信号促进斑块内脂质的移出，逆转动脉粥样硬化病灶。
　　方法：
　　27只雄性新西兰大白兔（2.0-2.5kg）高脂高胆固醇饲料喂养12周，兔动脉粥样硬化疾病模型形成。随机将其等分为三组：
　　(1)对照组（Control组/C组，n=7）：生理盐水（1mL/kg,隔日一次）腹腔注射;生理盐水（100 mL/kg,每日一次）灌胃；
　　(2)雷帕霉素干预组（Rapamycin组/R组，n=8）：雷帕霉素（1mg/kg,隔日一次）腹腔注射;生理盐水（100 mL/kg,每日一次）灌胃；
　　(3)雷帕霉素+尼克酰胺干预组（Rapamycin+Nicotinamide组/R+N组，n=8）：雷帕霉素（1mg/kg,隔日一次）腹腔注射;尼克酰胺（100 mg/kg,每日一次）灌胃。
　　对各组药物处理共6周。我们在药物干预前后分别于兔耳缘静脉抽血2ml送检行血脂三项检测。用药期间定期监测并记录动物体重变化情况。药物干预完毕后麻醉放血处死小动物，取其整根主动脉，胸主动脉部位整体油红O染色比较各组间斑块大小；主动脉根部冰冻切片油红O染色计算各组斑块面积占总动脉管腔面积百分比；同一部位主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉段石蜡切片HE染色镜下观察各组斑块病理学形态，并计算各部位斑块的平均厚度；其余主动脉用于实时荧光定量PCR检测主动脉及斑块内 mTOR、p70S6K、SIRT1、LXRα、CCR7 mRNA表达量情况。
　　结果：
　　1.新西兰大白兔药物干预6周中，对照组死亡1只，尸解死因考虑肺部感染；雷帕霉素组死亡4只，尸解死因考虑肺部感染、肝硬化晚期、不明原因心包积液、厌食、小肠黏连、腹泻；雷帕霉素+尼克酰胺组死亡5只，尸解死因考虑同雷帕霉素组。
　　2.在药物干预期间动物体重变化方面，各组新西兰大白兔体重变化差异具有统计学意义。其中R组、R+N组较C组体重均有所减轻，R组较R+N组体重变化则无统计学差异。
　　3.在药物干预前后血脂检测方面，C组、R组LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）水平较用药前下降，R+N组变化则无统计学差异。各组TG（总甘油三酯）、HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）水平用药前后未见差异。各组之间TG、LDL-C、HDL-C比较无显著差别。
　　4.在各组斑块面积占总动脉管腔面积百分比中，与C组相比，R组主动脉根部斑块面积百分比减小；R+N组则无显著差异。R组与 R+N组主动脉根部斑块面积百分比差异无统计学意义。
　　5.在各组斑块平均厚度测量中，主动脉弓部：R+N组斑块平均厚度值较 C组小；R组与C组之间以及R组与R+N组之间斑块厚度差异无统计学意义。胸主动脉部：R+N组斑块平均厚度值较R组小；R组、R+N组与C组之间斑块厚度差异无统计学意义。腹主动脉部：R组、R+N组斑块平均厚度值较C组小；而R组与R+N组之间斑块厚度差异无统计学意义。
　　6.在各组主动脉及斑块的实时荧光定量PCR中，与C组相比，R组主动脉及斑块中LXRα、CCR7 mRNA表达水平增高，mTOR、p70S6K mRNA表达水平下降，SIRT1 mRNA表达水平差异则未见统计学意义；R+N组主动脉及斑块中SIRT1、LXRα、CCR7、mTOR、p70S6K mRNA表达水平差异均未见统计学意义。与R组相比，R+N组SIRT1、LXRα、CCR7 mRNA表达水平下降，而mTOR、p70S6K mRNA表达水平差异则未见统计学意义。
　　结论：
　　上述结果提示mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素能够逆转动脉粥样硬化病灶，促进粥样硬化斑块的消退。雷帕霉素极有可能通过抑制 mTOR信号进而增强 SIRT1-LXRα-CCR7信号促进斑块内脂质的移出，缩小动脉粥样硬化病灶。与此同时，本次动物实验中观察到雷帕霉素显著的毒副作用，将来是否支持临床用药需待更进一步的权衡。

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缩略词对照表

目录

第一章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究课题的基金来源

1.3 研究目的和意义

1.4 研究内容

1.5 本研究的创新点

第二章 实验材料和仪器

2.1 实验动物

2.2 主要药品与试剂

2.3 主要仪器

第三章 实验方法

3.1 实验动物分组与处理

3.2 标本制备与取材

3.3 血脂检测

3.4 胸主动脉整体油红O染色

3.5 主动脉根部油红O染色后冰冻切片

3.6 各主动脉段石蜡切片的制作

3.7 苏木素-伊红染色（HE染色）

3.8 实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)

3.9 实验结果统计学分析

第四章 实验结果

4.1 实验动物新西兰大白兔的状态

4.2 三组新西兰大白兔药物处理前后体重与血脂的监测

4.3 主动脉整体油红O染色及计算斑块面积百分比

4.4 主动脉各段HE染色观察病理学改变及各段斑块厚度的测量

4.5 实时荧光定量PCR结果

第五章 讨论

（一）雷帕霉素干预后实验动物体重减轻

（二）雷帕霉素干预后实验动物血脂改变情况

（三）雷帕霉素逆转动脉粥样硬化斑块病灶

（四）药物干预后三组新西兰大白兔动脉粥样硬化斑块中，mTOR信号和SIRT1信号之间存在联系

（五）在逆转粥样硬化斑块过程中，雷帕霉素通过抑制 mTOR 增强SIRT1-LXRα-CCR7信号通路，促进脂质移出

（六）雷帕霉素用药过程中观察到的毒副作用

第六章 结论

参考文献

附录1 试剂配制

附录2 综述: Rapamycin, A Potential Therapeutic Method In Atherosclerosis?

附录3 英文投稿文章

致谢

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