联合应用ROCKⅡ及GSK-3β抑制剂对缺氧缺血脑损伤新生大鼠神经元细胞骨架稳定作用研究

摘要

目的：
　　本实验以新生SD（Sprague Dawley）大鼠为研究对象，观察分别应用Rho-GTP酶（ROCKII）抑制剂法舒地尔（Fasudil）、GSK-3β激酶抑制剂TDZD8以及两者联合应用对缺氧缺血脑损伤（Hypoxic Ischemic Brain Damage，HIBD）大鼠脑海马组织神经细胞形态、肌动蛋白相关通路（Rho/ROCK信号通路）以及微管蛋白相关通路（PI3K/AKT/GSK-3β信号通路）中重要蛋白表达水平的变化，以及对细胞凋亡的影响，探讨同时抑制影响轴突生长的两个关键酶ROCKII和GSK-3β激酶，能否使肌动蛋白F-actin及微管蛋白β-tublin降解破坏减少，了解联合用药的神经保护作用，为临床上开发联合用药治疗新生儿缺氧缺血性脑病提供实验依据。
　　材料与方法：
　　采用出生7天SD大鼠，随机分为正常组、假手术组、HIBD组、溶剂组、Fasudil组、TDZD8组、联合用药组。参照Rice方法制作HIBD模型；Fasudil组、TDZD8组、联合用药组及溶剂组大鼠在制作HIBD模型后0h、24h、48h各腹腔给药或生理盐水（NS，normal saline）一次，72h处死，取大鼠脑海马组织，HE染色观察组织细胞形态学变化；Western Blot检测海马组织ROCKII、F-actin、p-GSK-3β、β-tubulin蛋白表达量；TUNEL染色检测海马组织细胞凋亡情况。实验结果采用SPSS for Windows21.0统计软件进行资料分析，数据用均数±标准差（x?s_）表示，采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），数据进行方差齐性检验，若方差为齐性，组间两两比较以Scheffe方法分析；若方差不齐，以Dunnett T3方法分析。P<0.05为差别有统计学意义。
　　结果：
　　1.HE染色观察各组海马组织神经细胞形态
　　正常组及假手术组细胞结构较清晰、排列有序，组织细胞间隙正常，细胞核清晰可见，胞浆染色均匀。HIBD组及溶剂组细胞结构不清，可见细胞胞体肿胀呈气球样变，神经元数目减少，部分区域可见细胞核固缩等坏死性改变及神经胶质细胞增生。Fasudil及TDZD8干预组细胞形态有所改善，但密度仍较正常组减低，少部分区域可见细胞出现皱缩改变。联合用药组细胞组织结构基本完整，大部分细胞核清晰可见，神经细胞的坏死及变性程度较HIBD组明显减轻。
　　2.TUNLE染色检测各组海马组织神经细胞凋亡情况
　　正常组、假手术组、HIBD组、溶剂组、Fasudil组、TDZD8组、联合用药组细胞凋亡率分别为：9.27±1.48，12.31±1.65，65.14±3.74，68.79±3.26，47.31±2.95，45.58±2.42，14.27±1.51（P<0.05）；Fasudil组及TDZD8组均较HIBD组相比细胞凋亡减少（P<0.05），但仍低于正常组（P<0.05），而联合用药组能较显著改善细胞凋亡情况，与正常组对比差异无统计学意义（P>0.05）。
　　3.Western Blot方法检测肌动蛋白、微管蛋白及其上游蛋白表达情况
　　HIBD组海马组织F-actin及β-tubulin蛋白量均明显低于正常组（P<0.05）；分别给予药物Fasudil或TDZD8干预后，细胞骨架蛋白降解减少，F-actin及β-tubulin蛋白表达有所增加，其中，β-tubulin蛋白表达与HIBD组相比有差异（P<0.05）,而F-actin与HIBD组相比无统计学差异（P>0.05）；联合用药组F-actin及β-tubulin蛋白表达较分别给药时增加更明显，与HIBD组相比有统计学意义（P<0.05）。同时，HIBD组ROCKII蛋白表达明显高于正常组（ P<0.05）， p-GSK-3β蛋白表达明显低于正常组（ P<0.05），推测Rho/ROCK及AKT/GSK-3β两条信号通路参与细胞骨架降解过程，同时使用两条通路的抑制剂可通过减少细胞骨架蛋白的降解，稳定神经元细胞骨架，从而发挥神经保护作用。
　　结论：
　　缺氧缺血损伤后，神经细胞可见水肿、变性、坏死等病理改变，细胞骨架重要组成蛋白表达量减少，神经元细胞骨架降解，细胞凋亡增加。单一给予药物Fasudil或TDZD8干预后，神经细胞变性、坏死程度稍减轻，神经元细胞骨架降解减少，细胞凋亡减轻，提示两者对缺氧缺血脑损伤神经组织均有保护作用。而两者联合干预作用后，其减轻神经细胞损害作用较单一给药时更加显著，提示联合用药可进一步稳定神经元细胞骨架，增强神经保护作用。