南方养殖仿刺参肠道菌群结构分析及潜在益生菌的特性研究

摘要

近年来，益生菌产品的应用作为一种高效安全的疾病预防方法在水产养殖中得到普遍使用。本研究采用高通量测序技术对大连、烟台、霞浦和莆田4个不同地区养殖的仿刺参的肠道菌群结构进行分析，比较了4个产地的仿刺参肠道菌群结构之间的差异；从福建霞浦和莆田地区养殖的仿刺参肠道内分离培养得到451株菌，经过对特定病原菌的拮抗性剖析和安全性测验筛选出3株安全的仿刺参潜在益生菌；初步验证了三株潜在益生菌的益生效果；将不同浓度的潜在益生菌混合在饲料中喂养仿刺参观察其对仿刺参特定生长率、肠道菌群结构和非特异性免疫的影响，为益生菌在仿刺参养殖中的运用提供了一定的依据。
　　1、采用高通量测序技术对大连、烟台、霞浦和莆田4个不同地区养殖的仿刺参肠道菌群结构进行分析。本研究通过高通量测序技术发现，大连池塘养殖仿刺参的肠道菌群以变形菌门（Proteobacteria）为主，在整个仿刺参肠道细菌群落中占60.90％。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）占比为25.24%。烟台池塘养殖仿刺参的肠道菌群以变形菌门（Proteobacteria）为主要优势菌群，在细菌群落中占87.48%。福建吊笼养殖仿刺参的肠道菌群以厚壁菌门（Firmicutes）为主，在细菌群落中占59.04%，其中主要为乳球菌属和芽孢杆菌属。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）其占比分别为29.86%和8.14%，位列二、三次。采用分离培养法从霞浦、莆田养殖的仿刺参肠道中分离得到451株菌，使用16S rDNA序列分析技术对这些菌株进行了分子鉴定。福建池塘养殖仿刺参的肠道菌群总体以厚壁菌门（Firmicutes）为主（主要为芽孢杆菌属和乳球菌属），其次为拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。在霞浦海上吊笼养殖的仿刺参的肠道内经过分离鉴定的240株菌株分别属于三个不同的门、11个属和34个种。在莆田池塘养殖仿刺参的肠道内经过分离鉴定的211株菌株分属于三个不同的门、11个属和49个种。
　　2、通过对特定病原菌的拮抗性实验，菌株CQN-2、CQN-12和CQN-39对创伤弧菌等病原菌具有较明显的拮抗作用。经鉴定，这三株菌分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。潜在益生菌的安全性检验包括药敏分析和毒力分析两个方面：选取7大类14种常用抗生素对潜在益生菌的药物敏感性进行分析，通过人工感染实验验证潜在益生菌对仿刺参成活率的影响。药敏结果显示，3株潜在益生菌均对50%以上常用抗生素表现敏感性；人工感染实验结果表明，以105、107及109cfu/mL菌浓度的CQN-2、CQN-12、CQN-39浸浴后仿刺参的成活率均高于同浓度的塔氏弧菌处理组（阳性对照）和生理盐水处理组（阴性对照）。
　　3、研究3株潜在益生菌对仿刺参生长、免疫和肠道菌群结构的影响，以探讨3株潜在益生菌的益生效果。实验以初始体重为20±2.5g（平均值±SE）的仿刺参为研究对象，在基础饲料中分别添加不同剂量（0、107cfu/g或109cfu/g）的潜在益生菌，在室内循环水系统中进行了为期60d的养殖实验。实验结果表明，饲料中添加潜在益生菌能够显著提高仿刺参的生长速率，CQN-12在107cfu/g下混合饲料投喂仿刺参可以显著地提高 SOD、CAT、LSZ、p105和p50在肠道内的基因表达量，促进仿刺参的免疫能力。CQN-2在107cfu/g下混合饲料投喂仿刺参可以显著地提高SOD、CAT、LSZ、p105和p50在呼吸树内的基因表达量，增强仿刺参的免疫能力。两种益生菌都是在107cfu/g下对仿刺参免疫效果显著高于CK和109cfu/g。CQN-39在本研究中对仿刺参的免疫能力具有一定的增强作用，但是效果并不显著。菌群结构分析结果表明，CQN-2和CQN-12实验组在投喂后可显著降低仿刺参肠道内弧菌水平，同时显著提高芽孢杆菌、乳球菌的含量，而CQN-39实验组虽然弧菌含量也得到明显抑制，不过芽孢杆菌水平未得到显著提高，表明该菌在仿刺参肠道内的定植效果不理想。以上结果表明，潜在益生菌CQN-2在本实验条件下以107cfu/g菌浓度投喂添加时效果最佳，可以显著改善仿刺参的肠道微生态环境并提高其免疫力，并以此促进仿刺参的生长。
　　综上所述，本研究筛选得到的3株仿刺参潜在益生菌，其中CQN-12和CQN-2可以有效地改善仿刺参肠道内环境，促进仿刺参的生长并提高其免疫力。本研究为仿刺参益生菌的研究使用提供了一定的理论依据，为益生菌在福建地区仿刺参养殖中的推广使用奠定了基础。

目录

声明

缩略语

第一章 前言

1.1 仿刺参

1.2微生物的鉴定技术

1.3微生态制剂

1.4 仿刺参的免疫系统

1.5 研究意义

第二章 南北方仿刺参肠道菌群结构分析

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 福建养殖仿刺参肠道菌的分离培养及鉴定

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3讨论

3.4 小结

第四章 潜在益生菌的筛选与安全性检验

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 3株仿刺参肠道潜在益生菌对仿刺参生长、免疫及肠道菌群的影响

5.1材料和方法

5.2 结果

5.3讨论

5.4 小结

总结与展望

总结：

展望：

参考文献

致谢

论文撰写与学术交流