家族性骨髓增殖性疾病中JAK2基因突变的检测及意义

摘要

研究背景和目的： (1)慢性骨髓增殖性疾病(Chronicmyeloproliferativedisorders，MPD)是以骨髓中一系或多系髓系细胞增殖为特征的克隆性造血干细胞的疾病，经典MPD包括真性红细胞多症(PV，polycythemiavera)、特发性血小板增多症(ET，essentialthrombocythemia)、慢性特发性骨髓纤维化(IMF，idiopathicMyelofibrosis)、慢性髓细胞白血病(CML，chrorlicmyelogenousleuKemia)。(2-5)目前研究认为酪氨酸蛋白激酶(PTK，proteintyrosinekinase)信号转导途径的过度激活是MPD重要的发病机制，而除了CML具有特征性的Ph染色体和BCR/ABL融合基因外，PV、ET、IMF等其它Ph染色体阴性疾病的发病机制目前仍不明确。(8-11)JAK2基因是定位于9号染色体上的一种胞质蛋白质酪氨酸激酶，属于JAKS家族，在细胞因子的信号转导中起重要作用。2005年，有学者(12-15)先后发现在Ph染色体阴性MPD的绝大多数PV及部分ET、IMF患者中存在一种高致病性的获得性突变-酪氨酸激酶JAK2V617F，研究发现JAK2突变的发生率在PV患者中为74％-97％，ET为33％-57％，IMF为35％-50％，并通过转基因小鼠骨髓实验(1，19-21)实可引起类似PV的一些临床表现，提示JAK2基因突变在MPD的发病中可能起重要作用。但对于JAK2V617F突变在MPD发病中的确切作用及机理，目前仍未有较为统一的认识。另外JAK2V617F突变阴性的MPD，是否与(37-40)MPLW515L/K突变有关?是否存在JAK2v617F突变之外的JAK2基因的其它点突变?这些都是人们关注的热点。 MPD患者大部分为散发性的个体发病，有关家族性MPD发病的相关报道较少见。(6，57)家族性骨髓增殖性疾病(FamilialMPD)通常包括两种不同的血液系统疾病，一种是由于血小板生成素(54-54)(TPO，thrombopoietin)及其受体(58)(thrombopoietinreceptor，c-mpl)基因(55，63)突变引起的原发性血小板增多症，以及由于红细胞生成素(56-57)(EPO，erythropoietin)受体基因突变所致的原发性红细胞增多症。这部分患者大多为先天性发病，家族成员中所有患者均表现为血小板增多或者红细胞增多。目前已经证实一些相关的致病性基因(TPO、EPO)突变的存在；同一家族中出现二例及二例以上骨髓增殖性疾病患者也称为家族性骨髓增殖性疾病，其疾病亚型可以相同，也可以表现为不同类型的MPD(6)。研究显示，JAK2V617F突变不仅存在于散发性的部分MPD患者中，也存在于家族性MPD患者中。由于家族性MPD的发病率并不高，目前有关研究国外报道不多，而国内未见家族性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突变的相关报道。 本研究主要以2例先后在我院住院的同胞兄弟MPD患者及该家族其余成员为研究对象，通过检测外周血细胞计数、PER产物DNA直接测序及限制性内切酶方法进行JAK2V617F突变检测及其它相关检查，了解在该家族成员中JAK2V617F突变的发生情况，以进一步了解JAK2V617F突变在该家族中是否存在家族遗传性，同时我们对部分JAK2V617F突变阴性的MPD患者中MPLW515L/K突变、家族性红细胞增多症中EPOR基因突变及家族性血小板增多症中TPO、c-mpl基因突变进行检测，以了解这些突变在该家族中的发生情况，为进一步了解、阐述家族性骨髓增殖性疾病的发生机制，以及可能的遗传方式及在提供理论依据。 研究方法： 1.该家族成员进行外周血标本采集，并行血常规及流式细胞学检查(主要包括CD34、CD41、CD61、CD71、CD117、GPA)，了解家族成员的血常规基本情况及外周血细胞中红系、及巨核系及淋巴细胞亚群等相关分化抗原指标表达情况。 2.必要时行骨髓细胞形态检查和骨髓组织活检病理学检查。 3.通过溶解红细胞方法分离外周血有核细胞，并提取DNA，并参考文献(13-17)以包括JAK2基因V617密码子位点设计引物，普通PCR方法扩增目的基因，电泳确定扩增目的条带，PCR扩增产物经纯化后用BsaXI限制性内切酶消化。 4.PCR联合测序方法探讨部分JAK2V617F阴性的ET及IMF患者中是否存在另一种获得的功能性基因突变-MPLW515L/K。 5.在家族遗传性血小板增多症家庭成员中，应用PCR、DNA测序的方法，对所有家族成员进行TPO、c-mpl基因突变的检测，特别是针对两位血小板明显升高的成员及其后代家族成员。 6.检测家族成员中有关EPOR基因常见突变的检测，特别是PV患者及其后代家庭成员，了解在这些家族成员中是否存在这些致病性的基因突变。 结果： 1.我们首先对二例家族性骨髓增殖性疾病患者及其家族其余成员进行血常规及外周血流式细胞学检查，了解成员血常规基本情况及外周血细胞表面红系、巨核系等分化抗原表达情况，结果发现家族中除了两位MPD患者外，多个成员血细胞计数或位于正常值或高于正常值。另有一位家族成员检查血常规示血小板明显高于正常水平，同时流式细胞学检查结果也发现相关表面抗原的异常表达，并且结合骨髓细胞形态学、骨髓组织病理学诊断为该家族中第三个MPD患者。 2.结果发现在该家族中有三位成员为JAK2V617F突变阳性，包括二例MPD患者，(ET及PV各一例)，一例为其父亲，白细胞计数明显升高但无临床表现，因其拒绝行骨髓穿刺及其它相关检查，诊断尚不明确。通过调查我们发现，三例患者均为男性，且在二代家庭成员中发病，是否该家族中所有男性均可能出现JAK2V617F突变，我们重点对家族第三代成员中的二例男性青少年成员进行JAK2V617F突变检测，但未能在这二例成员中发现该突变。而另一例血小板明显高于正常水平的女性成员被诊断为JAK2V617F突变阴性的MPD。 3.在一些JAK2V617F突变阴性的ET及IMF患者存在的MPLW515L/K突变在该家族成员中也为阴性，并且家族遗传性血小板增多症存在的c-mpl基因突变(TPO基因突变检测部分目前正在实验中)及家族遗传性红细胞增多症中存在的EPOR基因突变均未能在该家族的成员发现。 结论： 结合实验结果，提示在该家族中可能存在某种遗传易感性使得这些成员更容易发生MPD以及有必要对该家庭成员定期进行血常规及其它相关检查，了解是否有向MPD发展的趋势。本研究对一家族性MPD的家庭成员进行调查及研究，为我们更好的了解JAK2V617F、MPLW515L/K、TPO、c-mpl、EPOR等这些在MPD(包括散发性及家族性)常见的基因突变在该家族性MPD的成员中的发生情况，以进一步了解这些突变在家族性MPD发病机制中的作用，为进一步阐明Ph-MPD的发病机理、治疗提供一些理论依据，特别是在疾病的早期发现、诊断、预防等方面。由于国内未见家族性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突变的相关报道，因此本研究在国内处于领先水平。 展望： 我们将对整个JAK2基因全长序列进行扩增，通过直接测序了解在该家族中JAK2基因除常见的V617F点突变外，是否存在其它共同的点突变而在该家族成员中引起发病，如存在突变并试图对这些突变在该家族MPD的发病中可能的作用及机理作进一步了解及探讨。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分家族性MPD的诊断及临床特点

第二部分JAK2V617F突变的检测

第三部分MPLW515L／K基因突变检测

第四部分TPO、c-mp1基因突变检测

第五部分EPOR基因突变的检测

全文讨论及小结

参考文献

附录 英文缩写词表

综述 家族性骨髓增殖性疾病

在研期间发表论文

致谢

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