小肠结肠炎耶尔森氏菌感染在腹泻病人中的临床调查

摘要

背景和目的: 本次实验研究充分使用改良培养方法和RT-PCR作为检测手段，两者优劣互补，既可利用RT-PCR在较短时间内提供结果供临床医生参考，又可利用改良培养方法对RT-PCR结果进行再次验证以及对所分离的致病株进行药敏试验。此外，两者同时使用还可以提高检出率。 目前，在中国或其他一些发达国家，由于近年来Y.e的临床流行病学资料缺乏以致许多医生不了解或较少关注耶尔森菌病的发生。此外，培养方法繁琐费时且检出率低，所以在以前单纯利用培养方法检测腹泻粪便中的Y.e会降低检出率或发病率，难以真实反映客观情况。因此在这次研究中，我们采集大量（2600例）腹泻粪便并利用已建立的RT-PCR和改良培养方法进行检测，目的是：1、初步探讨近年Y.e感染在腹泻病人中的临床特征，包括发病率、传染源、临床表现、并发症、治疗和预后，为医生提供有价值的临床信息；2、再次验证RT-PCR和改良培养方法的吻合度，为临床提供快速检测。 材料和方法: 一、样本来源和病人信息记录 于2005年5月至2008年5月从南方医科大学附属医院采集2600例（男：女=1540：1060，儿童：成人=1446：1154，春：夏：秋：冬=469：500：775：856，市民：农民=1466：1134）门诊及住院腹泻病人的粪便样本（每天大便次数大于3次，并伴随性状改变，如水样），置于Cary-Blair保存液中送检（lg粪便+5ml保存液）。所有病人年龄介于3个月至83岁。儿童定义为18周岁以下，成人则为18周岁以上。耶尔森菌病定义为除相应临床症状外还需要从腹泻粪便中由改良培养方法或RT-PCR检出致病性Y.e。 初诊时记录病人的姓名、地址、电话、年龄和基础疾病等资料，必要时电话咨询。对于阳性病人，追踪记录其临床信息，包括大便细菌检查、血液细菌培养和细菌药敏试验等。所有记录均取得病人和主管医生的同意。 二、改良培养方法检测腹泻粪便 1.粪便的处理：称取Cary-Blair保存液中粪便0.5g，加入4.5ml生理盐水中，均匀混合后取500ul至4.5ml增菌液（YSE）中培养。 2.YSE-CIN法：将500ul的粪便混液加入至4.5ml YSE中于16℃培养48小时，然后取5ul接种于CIN平板上于25℃培养24小时后立即挑取可疑菌落培养（25℃，16小时，脑心淬液），再进行初筛试验和生化反应，同时以标准菌株作为阳性对照，以生理盐水为空白对照。 3.初筛试验和生化试验：触酶（+）试验及尿素酶（+）试验于1小时内出结果。其余生化试验为动力37℃（-）、25℃（+），氧化酶（-），苯丙氨酸（-），V-P（+），甘露醇（+），山梨醇（+），纤维二糖（+），绵子糖（-），蜜二糖（-），鸟氨酸脱羧酶（+），赖氨酸脱羧酶（-），西蒙氏枸椽酸盐（-），克氏枸椽酸盐（+）。上述生化试验的反应温度为25℃，结果符合且七叶苷（25℃）、水杨苷（37℃）均阴性为致病菌，而均阳性为非致病菌。 三、Real-time PCR检测腹泻粪便 1.粪便的处理：称取Cary-Blair保存液中粪便0.5g，加入4.5ml生理盐水中，均匀混合后取500ul至4.5ml增菌液（YSE）中培养（16℃18h），再取200ul混合物提取DNA。 2.采用文献使用的引物和探针并委托公司合成。引物5'-ATCCCAATCACTACTG ACTTC-3'和5'-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3'（上海生物工程有限公司）及荧光探针FAM5'-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3'BHQ（德国Qiagen公司）。引物和荧光探针合成后用TE缓冲液稀释为3umol/l和0.4 umol/l，放冰箱避光保存。引物与荧光探针结合至目的基因（yst，GeneBank X65999），当聚合酶延伸遇到探针时，荧光探针被剪切并释放荧光素FAM，系统因此检测出一个目的基因扩增从而进行定量。该扩增产物长度为145bp。 3.反应体系：25uL反应预混合液（2×）、引物300nmol/l（5+5ul，3umol/l）、荧光探针40nmol/1（5ul，0.4umol/l）、BSA0.1 ug/ul（5uL，1ug/uL）、模板5ul，总体积50ul。 4.反应条件：95℃15min，35循环×（94℃30s，60℃60s）。每次反应都设立空白对照、阴性对照和阳性对照。本次实验以反应前后的荧光差值作为衡量标准，△RQ=RQ+-RQ-。阳性结果应大于4倍空白对照（无模板）或阴性对照（无致病性Y.e）的△RQ值，以便排除其它细菌。每管反应均重复3次。反应结束后记录每个样品的荧光值，并取其均数。 四、大便细菌检查、血液细菌培养和细菌药敏试验 阳性病人的大便细菌检查送检验科完成；出现败血症的病人需要进行血液细菌培养，送检验科完成；从改良培养方法分离得到的致病性Y.e均进行细菌药敏试验，送检验科完成。 五、生物分型和血清诊断试验 Y.e生物分型参考Bottone和Wauters所制定标准。 所购的诊断血清为Y.e O：3和O：9型，据说明书介绍不必稀释，直接使用。取洁净载玻片一张，吸取已知诊断血清1滴置于载玻片一端，另一端置生理盐水1滴作为对照。然后取菌液或菌落，分别置血清和生理盐水中混匀。在1-3min内，血清滴出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍均匀混浊，即为阳性凝集反应，说明被检菌与已知诊断血清是相对应的。如两者均混浊则是阴性反应，如两者均凝集则为自凝反应。按上述操作，以O：3和O：9型Y.e为阳性对照，以大肠杆菌为阴性对照。 六、统计学分析 RT-PCR和改良培养方法检出率的比较采用McNemer检验，其余统计分析采用卡方检验，如男女发病率、季节发病率和传染源构成比等。卡方检验和McNemer检验均采用SPSS13.0统计软件处理分析。 结果: 1、腹泻样本的检出结果和相关发病率的统计分析 RT-PCR和改良培养方法从2600例样本中共检出188例阳性样本，其中RT-PCR检出178例，改良培养方法检出160例。RT-PCR检出率高于改良培养方法，有显著性差异（X2=7.61，P=0.005）。若以改良培养方法为金标准，RT-PCR的特异性为99.59%，敏感性为93.75%，诊断符合率为98.54%。 在所有腹泻病人中，Y.e感染率/检出率为7.23%（188/2600）；男女之间发病率无显著性差异（X2=0.681，P=0.409），而儿童成人之间（X2=12.766，P=0.000）和市民农民之间（X2=11.288，P=0.001）则有显著性差异。 四个季节之间发病率有显著性差异（X2=19.676，P=0.000）。其中，春夏与秋冬季节之间发病率有显著性差异（X2=15.409，P=0.000），而秋冬季节之间则无显著性差异（X2=3.042，P=0.081）。儿童与成人在4个季节的发病人数构成比无显著性差异（X2=4.866，P=0.182）。 儿童于3岁以下的发病率高于3-18岁（11.2% VS6.4%，X2=26.782，P=0.000），而成人于60岁以上的亦高于18-60岁（7.0% VS3.1%，X2=8.96，P=0.003）。此外，3岁以下儿童（婴幼儿）和60岁以上成人由于免疫功能相对低下划分为高危人群。3岁以下儿童的发病率显著高于60岁以上的成人（11.2%Vs7.0%，X2=6.820，P=0.009）。 2、致病性Y.e的生物/血清型 从改良培养方法中检出160株致病性Y.e，包括生物/血清型1A/unknown（4株）、1B/unknown（8）、2/O：9（39）、2/unknown（7）、3/O：3（22）、3/unknown（6）、4/O：3（55）、4/unknown（10）和5/unknown（9）。没有发现混合感染的样本。 3、大便细菌检查和血液细菌培养 4、传染源 5、临床表现及并发症 6、病人家庭收入分布 7、细菌药物敏感试验 结论: 1、Real-time PCR检测粪便中Y.e快速简便（1.5天），结果准确可靠（特异性为99.59%，敏感性为93.75%，诊断符合率为98.54%），因此应推广至临床检测和临床调查中应用。 2、本次研究结果显示Y.e在腹泻患者中的检出率（7.23%）较以前（0.65%）已经显著上升，即其实有更多人是由于Y.e引起腹泻的，所以临床医生确实需要对Y.e感染的诊断、临床表现和治疗引起重视。也因为如此，建议Y.e检测纳入大便细菌检查或医院至少应该开展Y.e检测的项目。 3、耶尔森氏菌病主要表现为胃肠炎、假性阑尾炎和肠道外并发症。 4、当大便检测提示Y.e感染时，医生应首先选择磺胺甲基异噁唑、第三代头孢菌素、氨基糖甙类和氟喹诺酮类药物，之后再利用分离得到的致病株进行药敏试验并根据结果再调整用药。建议抗生素应在粪便Y.e检查阴性3-5天后才停止使用，以充分杀灭残余的Y.e。 5、在秋冬高发季节，当高危人群（3岁以下儿童和60岁以上成人）出现腹泻而未能最终确定病原体时，医生都应将相对少见的Y.e纳入考虑范围或作为鉴别诊断。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语中英文对照

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前 言

材料和方法

结 果

讨论与结论

参考文献

攻读学位期间成果

致 谢

统计学证明