腰椎间盘退变中软骨终板细胞的凋亡及CTGF对其保护作用的实验研究

摘要

研究背景和目的：:
　　 下腰痛是中老年患者的常见病和多发病,据不完全统计,我国45岁以上人群患病率约60～80％,也是影响人们工作、学习和生活的一个重要因素。多数引起下腰痛的因为是由椎间盘退行性病(disc degenerated diseases,DDD)直接或间接引起的。
　　 DDD是一个长期的过程,主要特点是由于部分蛋白多糖和含水的髓核内容逐渐丧失所致,并可以表现为多种临床症状和体征,如腰椎间盘突出症、椎管狭窄等。由此也给患者、家庭及社会带来巨大影响和经济负担。椎间盘是一个凝胶样缺血性密封良好的结构,内核(髓核)是由细胞基质及分散其中的髓核细胞组成；外侧由同心圆状排列的纤维环组成,并斜形连接相邻椎体终板结构。椎间盘的主要营养是通过相邻椎体表面的软骨终板的弥散途径而获取,缺血可导致椎间盘内部氧张力低,结果导致了髓核细胞进行无氧代谢。由此导致的高乳酸浓度和低pH值环境必然影响髓核的修复。在青少年时期,一个健康的髓核基质通常含有丰富的蛋白多糖和Ⅱ型胶原,水份超过85％；在成年人,蛋白多糖含量减少,而Ⅰ型胶原比例上升,水分含量降低到大约70～75％；老龄及退变时甚至进一步降低。部分炎性介质如基质金属蛋白酶(MMPs),前列腺素E2(PGE2),一氧化氮(NO),特别是白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)等参与椎间盘退变。蛋白多糖的丢失及退变密切相关,通常情况下,浓度较高的蛋白多糖会维持椎间盘内膨胀压力,并有助于保持椎间盘高度和椎间盘的承重能力。因此,蛋白多糖的损失可能会直接影响椎间盘生物力学性能,进一步影响负荷的小关节和其他结构,导致脊椎退行性改变。
　　 软骨终板营养物质弥散的不足是椎间盘退变的始动因素之一。作为人体最大的无血供结构,人体椎间盘在25岁之前并不表现明显的退变,这要归功于椎体终板正常生理功能的重要作用:终板将椎体与椎问盘分割并有效阻止了髓核突入椎体内；终板还有助于吸纳、缓存机械压力,避免损伤脊柱。腰椎软骨终板平均厚度约为1mm,而同一终板的不同部位厚度也不一致,往往是在中心毗邻髓核部位最薄。除了外侧纤维环能够提供少量营养供应,椎间盘的营养供应主要通过终板的弥散,主要的代谢物质交换也是通过终板进行。终板的生化组成,蛋白多糖对维持溶质分子的运输及水含量至关重要,终板中蛋白多糖的降低可导致髓核组织中蛋白多糖的减少。随着脊柱的发育,在骨骼成熟前终板中出现微血管并贯通上下,主要功能为向椎间盘输送营养。人体骨骼发育成熟后终板变进行重塑改造,逐渐矿化并最终为骨质代替,影响营养物质的渗透和代谢物的交换；同样终板内的微血管也由于钙化而闭塞,进一步限制营养物质的渗透。在腰椎退变中随增龄而显示终板形态变化愈发明显,并总是与椎间盘病理改变相关。早期的终板改变表现为显微镜下水平位的裂缝或裂隙,并可见细胞的凋亡。在腰椎退变的动物模型中证实了终板细胞凋亡的增加,也提示细胞凋亡参与增龄所致椎间盘的退变过程。
　　 细胞凋亡(apoptosisi),即程序性死亡(programme cell death,PCD),对细胞代谢而言是自然现象,从形态及生化反应上并有别于坏死。而后者一般是由于损伤、缺氧、低温或暴露在有毒环境中所致。Fas(载脂蛋白-1或CD95)是Ⅰ型膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子受体家族；Fas配体是Ⅱ型膜蛋白,属于细胞因子TNF家族。Fas受体与其拮抗体或配体结合触发细胞凋亡。Fas分布于哺乳动物各种细胞类型上。小鼠多种组织中有Fas mRNA分布,Fas mRNA在胸腺、心脏、肝脏、和卵巢(8周成年老鼠)高表达。Fas配体多表达在活化淋巴细胞、胸腺细胞和脾细胞等。Fas和Fas配体在终板组织中表达的研究尚未报道。这也是研究兴趣所在；如果终板软骨细胞表达Fas和Fas配体并能诱导细胞凋亡,这将意味着一个软骨退化机制:Fas及Fas配体可能在软骨细胞的退变及正常生长中发挥重要作用。
　　 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF/CCN2)是属于细胞间质蛋白,间质蛋白在调节细胞功能上发挥作用,在细胞的发生、发展及受损的情况下显著增加。间质蛋白一般在结构上有多种受体结合域,可结合多种受体、生长因子和蛋白酶以调节细胞之间或细胞与基质之间的活动。目前所知CCN家族有3位成员,具有相似的结构,即富含半胱氨酸的肝素结合蛋白,分子量为36～38 kDa并含349氨基酸。CCN2具有4个结构域,1.一个胰岛素样生长因子结合域(模块1)；2.血管性血友病因子(vWF)C型重复序列(模块2)；3.血栓重复域(模块3)和C端半胱氨酸结(半胱氨酸结)(模块4)。CTGF蛋白具有促有丝分裂、细胞粘附、细胞凋亡、细胞外基质分泌及细胞的迁移的功能。他们还调节转化生长因子(TGF)-β1、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)4和7的活动。在软骨形成中CTGF具有促细胞增殖和基质重塑作用,并可以调节血管生成。CTGF基因缺失小鼠出生后不久就由于骨骼和软骨缺陷死去。迄今为止,已经证明CTGF参与胚胎发育和分化、软骨骨化和女性生殖道子宫和卵巢功能的维持。此外,CTGF与肝纤维化、肿瘤发生、伤口愈合和肢体再生也有关系。CTGF蛋白及其核酸在组织起源的3胚层结构中均有分布,提示其与神经系统、血管、肌肉及骨组织的分化和发育中有关。CTGF参与多种基本生物学反应提示其可作为分子靶向药物的巨大潜力,在血管生成、软骨生成、成骨、神经传导及肌肉收缩方面有潜在的应用价值。
　　 本实验基于以往腰椎退变与细胞凋亡的关系及CTGF生物学功能效应研究基础上,以腰椎退行性变患者及新西兰大白兔和SD大鼠为研究对象,探讨腰椎退变与软骨终板细胞凋亡的关系及CTGF对其的保护作用,为揭示腰椎退变的机制和有效治疗途径作进一步探索。本实验主要进行以下3方面研究:1、腰椎退行性变软骨终板细胞的凋亡及与终板变化的关系(Modic)；2、建立动静力失衡兔腰椎退变动物模型并探讨其与终板细胞凋亡的相关性；3、CTGF对腰椎软骨终板细胞凋亡的保护作用。
　　 方法
　　 1.研究退行性腰椎疾患其终板细胞凋亡及与终板变化等临床特征的相关性。
　　 术中收集56例腰椎退行性变及8例未退变腰椎软骨终板标本,应用免疫组织化学和TUNEL法检测其细胞凋亡及凋亡因子fas的表达,研究其软骨终板细胞的凋亡和fas的表达是否与退变和增龄等临床特征有关；同时探讨终板改变是否对细胞凋亡有影响。即细胞凋亡及凋亡因子fas的表达在同年龄段的退变与未退变之间的比较；细胞凋亡及凋亡因子fas的表达在腰椎终板Modic改变组与未改变组之间的比较；终板Modic改变与腰椎不稳之间的关系；细胞凋亡及凋亡因子fas与年龄及退变程度的相关性分析。
　　 2.建立动物腰椎间盘退变模型,探讨腰椎退变与终板细胞凋亡的关系。
　　 取新西兰大白兔12只,手术对照组6只,手术模型组6只。后正中切口,剥离骶棘肌并向两侧分开,显露L1～6棘突,暴露双侧椎板、关节,咬除L1～6的小关节(包括上、下关节突)的外1/2部分,切断椎板间韧带；对照组仅行皮肤切开。笼中饲养3月后M R I检查大鼠腰椎的影像学改变,静脉注射空气处死后行组织免疫化学法检测椎间盘终板组织凋亡因子FAS的表达；TUNEL法检测椎间盘终板组织细胞凋亡情况；HE染色显示组织形态学改变:髓核皱缩情况,终板的钙化状况及纤维环的排列。
　　 3.CTGF对腰椎退变中终板细胞凋亡保护作用的研究
　　 取不同年龄段的大鼠腰椎间盘组织,免疫组织化学方法检测CTGF在终板细胞中的分布；分离和培养大鼠腰椎软骨终板细胞,同时对所培养的细胞进行鉴定并研究其生物学行为；建立营养不足型细胞凋亡模型并加入CTGF,MTT检测细胞的增殖和活性,Annexin-V/PI测其细胞凋亡情况,Western blot检测fas的表达,Real-time PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的表达,从细胞增殖与活性、凋亡情况、fas表达及基质合成评价CTGF抑制终板细胞凋亡的效果。
　　 结论
　　 1.腰椎退变终板细胞发生存在fas介导的凋亡,在MRI上显示的终板变化能够促进细胞的凋亡。
　　 2.腰椎失稳可以引起兔的椎间盘的退变,为不直接损伤椎间盘组织建立椎间盘退变动物模型的好方法,同时在动物模型中证实了腰椎间盘退变时终板细胞存在fas介导的凋亡。
　　 3.体外实验证实CTGF可以抑制大鼠腰椎终板细胞的凋亡、增强细胞的活性,这一功效可能是降低Fas表达的结果显现。在凋亡环境中CTGF可以增强终板细胞Ⅱ型胶原、aggrecan等基质合成能力,维持软骨细胞表型。

目录

文摘

英文文摘

前 言

参考文献

第一部分 腰椎退行性变终板细胞凋亡及与终板变化等临床特征的相关性研究

1.1 材料和方法

2.1 结果

2.3 讨论

2.4 结论

参考文献

第二部分 免腰椎间盘退变模型的建立及与软骨终板细胞凋亡关系的实验研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

参考文献

第三部分 CTGF对腰椎退变中终板细胞凋亡保护作用的研究

3.1 CTGF在不同年龄段大鼠腰椎软骨终板细胞中的表达

3.1.1 材料与方法

3.1.2 结果

3.2 大鼠腰椎软骨终板细胞的培养及鉴定

3.2.1 材料与方法

3.2.2 结果

3.2.3 讨论

3.2.4 结论

参考文献

3.3 CTGF抑制腰椎软骨终板细胞凋亡作用的研究

3.3.1 材料和方法

3.3.2 结果

3.3.3 讨论

3.3.4 结论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

附录

英文缩写及中英文对照

在校期间发表论文

致谢

统计学合格证明