共培养诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化及初步体内比较两种不同规格PLGA材料修复骨软骨缺损效果的实验研究

摘要

随着我国快速交通行业的飞速发展、逐渐进入老龄化社会，创伤、感染、退行性改变的发生日益增加，造成以关节软骨损伤为病理学基础的软骨缺损、骨关节炎等疾患，其所造成的关节疼痛和功能障碍已成为临床常见病与多发病，是一直是威胁人类生命健康的常见疾病，软骨损伤的修复是当前国际骨科学、运动医学以及生物材料学界研究的热点与难点问题，对此进行相关研究具有重要意义。
　　 但软骨损伤后自愈能力极差，原因可能与其细胞构成单一为已经分化成熟的软骨细胞及无血液和淋巴营养有关。软骨一旦发生损伤或者缺损往往会伴发软骨下骨的改变，软骨下骨作为关节软骨的坚强支撑，对于关节内应力传导发挥着重要作用。骨软骨缺损一旦发生，由于失去了坚强的软骨下骨支撑，软骨面局部的应力异常分布及塌陷难以避免，使关节发生不可逆性的退变，造成关节内异常骨化并最终强直，引起强烈、持续的关节疼痛和功能障碍。
　　 目前临床上较为成熟的软骨修复技术包括骨髓刺激和移植两大类:前者如软骨下钻孔术和微骨折技术;后者有自体骨软骨镶嵌成型术(Mosaicplasty)和自体软骨细胞移植(ACI)术。但上述技术本身均有其各自诸多的局限性。骨髓刺激技术仅能在修复区产生纤维软骨覆盖;而Mosaicplasty技术虽能恢复透明软骨覆盖，但其毕竟破坏了正常的健康组织，且供区有限难以满足更大面积缺损的需要，而可能产生的供区病也限制了其进一步的应用;ACI技术的修复效果令人振奋，但形成的软骨组织究竟是否透明软骨无法预期且手术复杂，价格昂贵。而更有研究表明，ACI所产生的软骨难以与软骨下骨宿主紧密结合，特别是在骨软骨复合型损伤情况下，ACI无法恢复软骨下骨的生物力学支撑，使得其在面对骨软骨复合型缺损时失去了优势。
　　 基于上述原因，迄今为止关节软骨损伤的临床疗效始终差强人意，更缺乏可以大规模临床应用的成熟的人工替代材料和组织工程关节软骨产品，组织工程学的发展为软骨缺损尤其是骨软骨复合缺损的修复提供了新的思路和技术方法，自从在裸鼠体内构建出耳廓软骨的这一组织工程学标志性成果发表至今10余年时间内，对于组织工程化关节软骨的构建与应用已进行了大量的研究工作，已在体外及多种动物体内构建出组织工程化软骨，充分显示了组织工程学方法与技术在修复关节软骨损伤中的巨大潜力与广阔的应用前景。
　　 采用生物材料复合各种细胞的软骨组织工程，是目前研究的热点，有很好的临床应用前景，已有部分技术、产品应用于临床，其技术主要包括种子细胞、支架材料和局部培养及诱导微环境三个方面，本实验主要在种子细胞和支架材料方面研究。
　　 软骨组织工程的种子细胞的较好来源之一是向成软骨分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，其中用软骨细胞与BMSCs共培养诱导BMSCs向软骨细胞方向分化是一种实用的策略。软骨修复常用的大动物模型是山羊，然而关于山羊软骨细胞与BMSCs共培养国内研究很少。BMSCs作为种子细胞有很好的应用前景，但是如何完美的诱导其向成软骨细胞分化，没有标准的方案，共培养诱导BMSCs向成软骨分化是可选的方案，其诱导效果不同物种有差异，且诱导效果不统一，有些研究BMSCs和软骨细胞共培养BMSCs向成骨分化，有些研究BMSCs向成软骨分化，故进一步验证大动物细胞共培养成是否成软骨仍有意义
　　 本实验第一部分重点观察山羊第三代软骨细胞与BMSCs共培养是否仍能应用于临床的第一二代自体软骨细胞植入术( ACI)软骨修复产品都存在着软骨的去分化问题，软骨去分化后变成纤维细胞样外观，细胞外基质collagenⅡ、GAG减少，collagenⅠ增加形成的透明软骨质量下降，一般第四代后开始表现明显，早期的共培养采用的软骨细胞一般是第二代(p2)以前的细胞，本实验重点观察山羊第三代软骨细胞与BMSCs共培养是否仍能通过旁分泌诱导BMSCs向成软骨分化。第二章主要比较两种PLGA支架材料修复骨软骨缺损能力，本研究的主要研究方法、内容和结论包括以下几个方面:第一章第1部分山羊骨髓间充质干细胞和山羊肋软骨细胞的获取、扩增与鉴定
　　 目的:
　　 获取用于作为种子细胞的两种细胞，并对其进行扩增、鉴定
　　 方法:
　　 1.山羊骨髓间充质干细胞的获取、扩增与鉴定
　　 用全骨髓法贴壁培养纯化山羊骨髓间充质干细胞，用含10％FBS的低糖培养液在37°5％CO2环境下培养扩增，将第三代BMSCs分别向成骨、成软骨、成脂诱导鉴定其多项分化能力，并做流式细胞鉴定其表面特征性CD分子。
　　 2.山羊肋软骨细胞的获取扩增与鉴定
　　 取山羊第12肋末端3cm，剪碎、胰酶、胶原酶程序消化，贴壁培养获取的软骨细胞在含10％FBS的低糖培养液在37°5％CO2环境下培养扩增，进行甲苯胺蓝染色鉴定其分泌细胞外基质能力。
　　 结果:
　　 成功分离、扩增出两种细胞，经鉴定复合上述BMSCs和山羊肋软骨细胞特征。
　　 结论:
　　 全骨髓培养法能够获取实验要求的较高纯度BMSCs，复合酶程序消化法能获取符合要求的肋软骨细胞。
　　 第2部分Transwell板平面共培养诱导山羊骨髓间充质干细胞向成软骨分化
　　 目的:
　　 观察与肋软骨细胞平面隔离共培养条件下，骨髓间充质干细胞向成软骨分化的能力
　　 方法:
　　 1.Transwell共培养体系的建立
　　 将获取扩增的肋软骨细胞和骨髓间充质干细胞分别种植于Transwell共培养板的小室层和孔板的底层，分2周、3周两个时间点软骨诱导，为实验组，相同细胞量种植于六孔板培养为阴性对照组，相同细胞量种植于六孔板用成软骨诱导液培养为阳性性对照组。
　　 2.共培养时间终点干细胞成软骨的检测
　　 2.1.大体形态改变观察、甲苯胺蓝染色及二型胶原(collagenⅡ)免疫荧光
　　 2.2.GAG定量检测评价共培养后BMSCs分泌透明软骨主要细胞外基质的能力
　　 2.3.Q-PCR检测成软骨及成骨基因表达
　　 2.4.统计学分析
　　 数据分析采用spss13.0统计软件包进行分析，Alamarblue法检测细胞增殖实验中，相同时间点两组之间的比较用两独立样本t检验;GAG定量、Q-PCR检测实验中同一时间点不同组比较方差齐时采用完全随机设计单因素方差分析(one-wayANOVA)，方差齐时用整体比较用F检验，多重比较用LSD法后检验;方差不齐时用Welch近似F检验，多重比较用Dunnett's T3法后检验。a=0.05为统计学检验水准。
　　 结果:
　　 共培养的过程中，BMSCs逐渐由长条状螺旋形排列纤维细胞样，转变为触角短的多角形上皮样细胞，甲苯胺蓝染色见共培养组有异染现象，对照组无异染情况，说明有酸性的GAG分泌增多;共培养组与阴性对照组相比，增殖能力在7天后被抑制（7天t=6.492 p=0.003;9天t=16.186 p=0.000;11天t=5.062 p=0.007）;在7天和21天两个时间点GAG定量检测共培养组（A组）与阴性对照组（C组）有统计学差异（7天F=98.956 p=0.002;21天F=905.167 p=0.000，后检验，7天t=40.877 p=0.018;21天t=151.341 p=0.000），21天时共培养组的GAG含量低于成软骨诱导液组（总体组间有差异21天F=905.167 p=0.000），后检验t=55.930p=0.000)。Q-PCR检测见14天时共培养组（A组）、成软骨诱导液组（B组）成软骨基因ColⅡ较阴性对照组表达增强（总体组间F=905.167 p=0.000，后检验与C组相比A组t=1.1693 p=0.000 B组t=1.940 p=0.000），但是伴随成骨基因osteopontin的表达增强(总体组间F=15.989 p=0.004，后检验与C组相比A组t=3.811 p=0.001 B组t=2.647 p=0.009)。
　　 结论:
　　 用第三代的山羊肋软骨细胞与山羊第四代BMSCs共培养，能在一定程度上诱导山羊BMSCs向成软骨分化，诱导效果弱于成软骨诱导液的诱导，但是两种诱导方法都伴随有成骨基因的表达，可能远期有成骨趋势，需引起注意。
　　 第3部分三维立体材料中山羊骨髓间充质干细胞与平面培养的肋软骨细胞共培养诱导向成软骨分化
　　 目的:
　　 观察三维培养环境中的干细胞与平面培养的肋软骨细胞共培养下，向成软骨分化的能力
　　 方法:
　　 1.支架材料与细胞的复合、共培养体系的建立
　　 用滴加法将1(x)107/ml的细胞悬液滴加到已经消毒、预湿的6mm(x)4mm的PLGA圆薄片支架材料上，贴壁后构建成细胞材料复合体。将细胞材料复合体放入底部预接种山羊肋软骨细胞的24孔板中培养为实验组，将细胞材料复合体放入底部未预接种山羊肋软骨细胞的24孔板中培养为对照组。
　　 2.共培养时间终点干细胞成软骨的检测
　　 共培养21天后，取出细胞材料复合体，石蜡包埋切片后做HE染色、甲苯胺蓝染色、ColⅡ免疫组化等组织学检测，评价其是否分泌软骨细胞外基质增多。
　　 结果:
　　 共培养21天后HE染色两组未见明显差别，支架材料的空隙中布满接种细胞，并分泌大量的细胞外基质。甲苯胺蓝染色见共培养组异染明显，对照组未见明显异染，ColⅡ免疫组化免疫组化示共培养组阳性，对照组阴性
　　 结论:
　　 三维支架材料中的山羊BMSCs在有肋软骨的环境下，组织学检测见成软骨基质分泌增多，可用来诱导或者协同诱导支架材料中负载的BMSCs向成软骨分化，细胞材料复合体可直接用于进一步的软骨缺损手术修复。
　　 第二章连通与不连通材料修复骨软骨缺损的效果比较
　　 目的:
　　 比较连通与不连通三相PLGA支架材料那种更能有效修复骨软骨缺损
　　 方法:
　　 1.BMSCs的获取、扩增、鉴定与标记
　　 从兔髂后上棘穿刺，用去昂骨髓培养法获取、扩增BMSCs，进行多向分化诱导，用PKH26进行标记
　　 2.PLGA支架材料的性状检测、消毒准备与细胞-材料复合体的体外构建扫描电镜观察支架材料性状及细胞的贴附，酒精、生理盐水法对材料进行消毒预湿，用纤维蛋白胶将BMSCs及诱导因子分层植入PLGA支架材料，构建成细胞材料复合体。
　　 3.新西兰白兔股骨内侧髁缺损模型制备与复合体植入在新西兰白兔股骨内侧髁做一4mm×4mm急性、极限缺损模型，将体外构建的复合体植入缺损。
　　 4.检测观察4周时进行答题形态、组织学染色、GAG定量、Q-PCR检测评价不同组软骨段成软骨效果。
　　 结果:
　　 肉眼观接种细胞的支架材料比不解中细胞的支架修复效果好，有一层软骨状修复物，两者修复效果均优于空白缺损组。GAG定量、Q-PCR检测成软骨基因发现两种规格的材料中，不连通材料的软骨段修复效果优于连通材料。
　　 结论:
　　 接种细胞的支架材料比不解中细胞的支架修复效果好，两者修复效果均优于空白缺损组。两种规格的材料中，不连通材料的软骨段修复效果优于连通材料。

目录

摘要

第一章

第一部分 山羊骨髓间充质干细胞和山羊肋软骨细胞的获取、扩增与鉴定

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第二部分 Transwell板平面共培养诱导山羊骨髓间充质干细胞向成软骨分化

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5 小结

第三部分 三维立体材料中山羊骨髓间充质干细胞与平面培养的肋软骨细胞共培养诱导向成软骨分化

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第一章 全文总结

参考文献

第二章 兔体内初步比较两种不同规格PLGA材料修复兔股骨髁骨软骨缺损的实验研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

中英文缩略词表

攻读硕士学位期间研究成果

致谢

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