免疫球蛋白C在前列腺癌细胞的表达及RNA干扰IGHG1基因表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

摘要

研究背景和目的:
　　 前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是威胁男性健康的常见肿瘤之一。在美国，PCa的发病率占男性恶性肿瘤的第1位，死亡率是11％，仅次于肺癌，列在肿瘤性死亡的第2位[1]。2004年美国大约有230，110例新发PCa，有29，900例死于此病。在全球范围，PCa的发病率占男性恶性肿瘤的第3位[2]。在欧洲，每年得到确诊的新发PCa病例大约有260万人，PCa占全部男性癌症人数的11％，占全部男性癌症死亡人数的9％[3]。近年随着人口老龄化及生活条件的改善，我国前列腺癌发病率有明显增加的趋势，逐年增加，1997年发病率约2.0人/10万男性人口，至2000年为4.55人/10万男性人口，在男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位[4]。
　　 但是迄今为止，前列腺癌的发病机制并未研究明晰，且前列腺癌的临床症状不典型，病情隐匿，临床上大约有1/3的患者在诊断时已经存在局部浸润或远处转移，已失去了手术治疗的机会，而采用以去势治疗为基础的内分泌治疗，其疗效常常不佳，该类患者的中位缓解时间18～20个月，对内分泌治疗失去疗效，最终所有病人都将进展为雄激素非依赖性前列腺癌和（或）激素难治性前列腺癌[5-9]。目前，对于中、晚期前列腺癌的治疗仍是个难题，如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌依然是研究的难点。目前国内外学者都在探求基因水平的调控方法和新靶点，因此，寻找有效的分子靶向治疗手段一直是近几年来前列腺癌治疗的热点[10，11]。
　　 经典的免疫学理论认为，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是B淋巴细胞的特征性产物，其他的体细胞不会表达Ig。但近年来的多位学者研究证实上皮来源恶性肿瘤如:乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌和消化道肿瘤等及软组织肉瘤均有Ig样物质表达，其具有促进肿瘤细胞生长的作用，并进一步证实在这些恶性肿瘤细胞中存在Ig基因的转录[12，13]。Golda等观察到前列腺癌患者体内血清IgG的浓度通常升高[14]。另Babbage等研究发现乳腺癌细胞分泌的IgG可激活诱导型二磷胆碱脱氨酶活性，具有进一步增强肿瘤细胞诱导发生异常突变的能力[15]。许多研究表明，在肿瘤的发生发展过程中，Ig发挥着重要作用。Zheng等[16]不仅证明许多非造血性细胞表达Ig，且进一步证实在人类上皮来源的癌细胞中，免疫球蛋白的基因转录物有着VDJ重组特征。国内有学者研究发现包括IgG在内的癌细胞源性Ig能够抑制效应Ig分子介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对上皮性肿瘤细胞的增殖能力有一定的促进作用。已经证实Ig的高表达与肿瘤临床分期、病理分级呈正相关，可作为评判肉瘤预后的指标之一[13,17]。通过抗人IgG抗体或用反义寡脱氧核苷酸封闭肿瘤来源的IgG活性，具有明显的抑制肿瘤细胞生长、降低IgG表达、诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制人上皮来源的肿瘤细胞在裸鼠体内的生长，这使其可成为肿瘤的分子靶向治疗提供潜在的靶点。
　　 前列腺癌的发生、发展与人体内雄激素密切相关，但其确切发病机制目前尚不清楚。有研究表明由上皮来源的肿瘤患者体内血清IgG、IgA或IgM抗体的浓度通常升高，这些肿瘤包括有乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肝癌和前列腺癌。但是对于检测Ig在前列腺癌中表达及功能研究，鲜见报道。国内外尚缺少雄激素倚赖型前列腺癌细胞株表达Ig，以及癌细胞从雄激素依赖型向雄激素非依赖型转化后表达Ig有无变化的相关研究。目前对癌细胞表达的Ig在肿瘤进展、转化时所起的正性推动作用的判断是否也适用于前列腺癌？阻止Ig表达或对抗Ig能否促进前列腺癌细胞凋亡？由此设想，如能证明在不同类型的前列腺癌细胞株可表达IgG，进一步研究针对IgG的分子靶向治疗的效果，可能为前列腺癌癌变机制提供新的线索，也将为中、晚期前列腺癌的生物治疗提供了一个新的靶点和研究方向。
　　 鉴于目前激素非依赖性前列腺癌和难治性前列腺癌对内分泌治疗、放疗及化疗等各种治疗均不敏感，患者中位存活时间短，积极寻找有效的分子靶向治疗手段成为当下研究的重点。陆续发现的前列腺特异性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等肿瘤相关抗原，为前列腺癌的免疫治疗提供了新的思路。根据药物作用的细胞信号靶点，近年来PCa分子靶向治疗主要着眼于:抗血管内皮生长因子(VEGF)、蛋白激酶抑制、表皮生长因子受体(EGRF)信号通路靶向抑制、内皮素信号通路拮抗等[18-22]。由于细胞信号转导系统是一个复杂的、多因素交叉对话的蛋白网络系统，大多数实体肿瘤都是多靶点、多环节的调控过程。处于不同分化阶段的肿瘤细胞表现出明显的异质性，使得单一途径的靶向治疗往往不足以遏制肿瘤进展。考虑到传统雄激素阻断疗法的单靶点性，今后肿瘤治疗和药物研发的方向将会转向多靶点联合阻断;致力于深入研究诱发激素难治性前列腺癌的最关键的信号转导通路，找出最敏感且特异性最高的治疗靶点;找出能预测前列腺癌预后和有激素难治性前列腺癌倾向的最敏感的指标，并设计出合理的检测方法，达到早发现、早治疗的目的。
　　 RNA干扰(RNAinterfernce，RNAi)是近期发展起来的一种新的基因治疗和诊断技术，RNA干扰是指利用小RNA（包括小干扰RNA即siRNA）序列抑制特定基因信号的过程。将具有特定序列的siRNA导入肿瘤细胞内，可引起同源序列mRNA的特异性降解，来高效特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞出现特定基因缺失的表型，从而达到某些实验或治疗目的，并广泛应用于肿瘤的基因治疗[23]，近年来，RNAi技术的发展为前列腺癌治疗的研究提供了一种新思路，我们设想通过RNA干涉的方法，抑制IgG的表达，诱导非激素依赖性前列腺癌细胞的凋亡，以探讨对非激素依赖性前列腺癌细胞的基因治疗。
　　 目的:
　　 (1)体外培养前列腺癌两种不同类型细胞株LNCaP、PC-3表达IgG的强度和部位，揭示PCa细胞表达Ig的基本特点。
　　 (2)通过对良性前列腺增生组织和前列腺癌组织表达IgG强弱的观察，探讨IgG在前列腺癌组织中的表达意义及与前列腺癌病理分级的相关性，初步明确IgG在前列腺癌发生、发展的可能关系，并探索IgG能否作为判断前列腺组织恶性度的指标。
　　 (3)构建并筛选出最有效的siRNA，RNA干扰PC3细胞IGHG1基因的表达，研究其对PC3细胞生物学行为如生长增殖、凋亡等的影响，为以IGHG1基因为靶点治疗前列腺癌寻找有效的治疗策略;并初步探讨沉默后诱导PC3细胞调亡的机制。
　　 方法:
　　 (1)通过培养LNCaP和PC3两种不同类型前列腺癌细胞株，采用流式细胞仪技术检测LNCaP和PC3细胞的IgG表达情况，进一步采用实时荧光定量PCR和Westernblot检测LNCaP和PC3细胞IgG1mRNA和IgG蛋白的相对表达量。
　　 (2)收集南方医科大学珠江医院泌尿外科前列腺癌根治手术标本，应用免疫组织化学技术采用Envision两步染色法检测前列腺癌和前列腺增生症组织中IgG的表达。
　　 (3)根据siRNA的设计原则设计并化学合成siRNA序列，筛选抑制效率最高的siRNA，复苏培养前列腺癌细胞株PC3至对数生长期，将抑制效率最高的IGHG1-siRNA转染入前列腺癌细胞株PC3中，观察转染效果，设转染组、空白对照组、阴性对照组三组;并通过荧光定量PCR和westernblot实验观察其下调IGHG1在人前列腺癌PC3细胞中表达的效率，检测转染后3个组IgG1-mRNA和IgG蛋白的表达变化。
　　 (4)采用流式细胞仪检测转染后前列腺癌PC3细胞凋亡的情况;MTS法检测转染后各组人前列腺癌PC3细胞的生长情况;并通过荧光定量PCR和Westernblot的方法检测下调IGHG1表达后Caspase3蛋白的表达变化。
　　 结果:
　　 (1)流式细胞仪检测LNCaP和PC3细胞株的细胞膜表面及胞浆内均有IgG的表达，LNCaP细胞胞膜及胞浆IgG阳性表达率为2.96％和89.22％;PC3细胞IgG阳性表达率为86.73％和90.99％。进一步通过荧光定量PCR和Westernblot检测LNCaP和PC3细胞的IgG1-mRNA和IgG蛋白的相对表达量。LNCaP细胞IgG1-mRNA相对表达量为1±0.37，PC3细胞IgG1-mRNA相对表达量为3.08±0.15，两组相比差异有统计学意义，t=0.295，P=0.001。Westernblot检测PC3和LNCaP细胞的IgG蛋白的相对表达量分别为1.92±0.15，1.05±0.86，两组相比差异具有统计学意义，t=0.238，P=0.001。
　　 (2)免疫组化示前列腺癌细胞染色呈不均一性，阳性反应主要位于胞浆。前列腺癌组织中IgG蛋白阳性表达率为91.1％(41/45)，而对照前列腺增生组织中IgG蛋白的阳性表达为12.5％(5/40)。两组比较差异有统计学意义(x2=49.585，P=0.000)。前列腺癌组织中IgG蛋白表达强度与患者年龄、PSA无关，P＞0.05，与Gleason评分病理分级呈正相关，rs=0.403，P=0.006，差异有统计学意义。
　　 (3)转染后，IGHG1-siRNA转染组的IgG1mRNA相对表达量为1.28±0.43，阴性对照组与空白对照组相的相对表达量分别为8.82±1.33、8.07±1.78;Western印迹检测转染后各组IgG蛋白水平上的表达变化，空白对照组和阴性对照组相对表达量分别为2.85±0.24和3.01±0.16，而siRNA转染组IgG蛋白相对表达量为1.24±0.11，转染组的IgG1mRNA和蛋白的相对表达量均有明显降低，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而阴性对照组和空白对照组两组相比较没有显著变化（P＞0.05）。
　　 (4)MTS法证实沉默IGHG1表达之后，在转染后48对前列腺癌细胞的生长具有明显的抑制效应，抑制前列腺癌细胞增殖，与空白对照组相比，差异具有统计学意义，P＜0.001，转染后对PC3细胞生长抑制作用随时间变化呈线性趋势，48和72小时的抑制率为31.3％、43.3％。各组PC3细胞转染48h后，流式细胞术检测示转染组的细胞凋亡率为5.29％±0.41％，促进细胞调亡，空白对照组调亡率为1.49％±0.29％和阴性对照组的调亡率为1.92％±0.17％，转染组与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，而阴性对照组和空白对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 (5)siRNA转染48h后，利用荧光定量PCR检测siRNA干扰组的caspase-3mRNA的相对表达量为3.93±0.28，阴性对照与空白对照组的相对表达量分别为2.51±0.43，2.47±0.36;经单因素方差分析，实验转染干扰组与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P=0.004)，而阴性对照组与空白对照组两组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。通过westernblot检测转染后各组细胞caspase-3蛋白的相对表达量，空白对照组和阴性对照组caspase-3蛋白相对表达量分别为0.92±0.12和1.06±0.14，两组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，而siRNA转染组caspase-3蛋白相对表达量为1.34±0.11，显著高于空白对照组及阴性对照组(P=0.014)。
　　 结论:
　　 (1)IgG在LNCaP和PC3细胞均有表达，PC3细胞中高表达，提示其与前列腺癌的恶性程度密切相关。
　　 (2)IgG在前列腺癌组织中高表达，与Gleason分级呈正相关，与前列腺肿瘤的发生、发展密切相关，并可作为前列腺癌预后的评判指标。
　　 (3)靶向IGHG1基因的RNAi可明显抑制PC3中IgG基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。靶向沉默PC3细胞中IGHG1基因的表达后，可明显抑制细胞的增殖，并可以诱发凋亡，以早期凋亡为主。沉默IGHG1基因诱导PC3细胞凋亡通过caspase-3凋亡信号通路所介导，IgG可以做为前列腺癌癌基因治疗的潜在靶点。

目录

摘要

第一章 免疫球蛋白G在前列腺癌细胞株表达的研究

1．1 材料与方法

1．1．1 实验材料与主要仪器

1．1．2 方法

1．1．3 统计学方法

1．2 结果

1．2．1 流式细胞仪检测IgG在LNCaP和PC-3细胞中的表达

1．2．2 荧光定量PCR检测LNCaP和PC-3细胞IgG1-mRNA的相对表达量

1．3 讨论

1．3．1 IgG在肿瘤细胞表达

1．3．2 IgG在LNCaP和PC3细胞表达意义

1．4 参考文献

第二章 免疫球蛋白G在前列腺癌组织中表达及临床意恧义

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料与一般资料

2．1．2 免疫组化染色检测前列腺癌标本和前列腺增生组织标本IgG的表达

2．2 结果

2．2．1 IgG在前列腺癌和前列腺增生症组织中的表达

2．2．2 前列腺癌组织中IgG的表达与临床病理特征的关系

2．3 讨论

2．4 参考文献

第三章 RNA干扰IGHG1基因表达对PC3细胞增殖和调亡的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料与主要仪器

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 主要试剂与配置

3．1．2 实验方法

3．1．3 统计学方法

3．2 结果

3．2．1 IGHG1-siRNA筛选抑制效率和转染效率

3．2．2 RNA干扰对IgG1mRNA表达的影响

3．2．3 沉默IGHG1后PC3细胞IgG蛋白表达的变化

3．2．4 siRNA干扰抑制PC3细胞的增殖能力

3．2．5 流式细胞仪检测转染后PC3细胞的调亡

3．2．6 荧光定量PCR检测转染后各组PC3细胞caspase-3 mRNA的表达

3．2．7 Western blot检测转染后各组PC3细胞Caspase-3蛋白的表达

3．3 讨论

3．3．1 前列腺癌的基因分子靶向治疗

3．3．2 RNA干扰技术在前列腺癌中的应用

3．3．3 沉默IGHG1诱导PC3前列腺癌细胞凋亡

3．4 参考文献

综述

缩写词简表

致谢

博士研究生期间发表论文情况

声明

统计学审稿证明