整合素α5在人牙髓干细胞增殖、迁移及成骨/成牙本质向分化中的作用

摘要

牙髓组织是一种疏松的结缔组织，其血液供应来源于根尖孔细小的血管，无有效的侧支血液循环，很难抵御外界的炎症等刺激。牙髓组织的损伤通常是不可逆的，可导致牙髓组织坏死并进一步向根尖周组织进展。寻找一种理想的牙髓病治疗手段是口腔科医师的共同目标。传统的根管治疗通过彻底去除感染的牙髓组织，切削感染的根管内壁，利用充填材料严密充填根管系统。虽然可以基本去除感染物，减小再感染的机会，但仍有着明显的缺陷:第一，充填材料和密封材料易使牙冠变色而影响患者的容貌美观;第二，根管治疗后，牙本质的抗折性能明显降低;第三，患牙经过完善的根管治疗后，依然较健康牙容易缺失。因此，恢复天然牙结构与功能成为了一种治疗需求。
　　 当牙髓受到外界刺激时，存在于髓腔内的未分化间充质细胞可分化为成牙本质细胞，参与牙髓组织的损伤修复过程，这为牙髓病的治疗提供一种更好的方法。2000年，Gronthos等首先提出成人牙髓中存在具备自我更新和多向分化潜能的前体细胞——人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)。在正常情况下，hDPSCs处于静息状态;当外界刺激造成牙本质细胞受损时，hDPSCs可增殖并迁移至受损区域，分化为成牙本质细胞，形成修复性牙本质，从而参与牙髓组织的损伤修复过程。hDPSCs正常的生长、增殖、迁移及成牙本质细胞向分化对于损伤修复过程非常重要。
　　 牙髓再生是利用组织再生技术使牙髓组织再生，替代损伤的由成牙本质细胞、血管、连接组织和神经等构成的牙髓组织，恢复天然牙髓组织的一种探索性生物学技术。成牙本质细胞再生、牙髓血运重建、神经再生和支架移植是牙髓再生必须面对的问题。其中成牙本质细胞的再生是牙髓组织再生的核心。hDPSCs作为一种重要的种子细胞，可诱导分化为成牙本质细胞，而其在小鼠体内可诱导分化为牙髓牙本质样复合体，进一步提示了其在牙髓组织再生中的重要作用。
　　 整合素是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，在人体各种组织中表达，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用;参与细胞的迁移、增殖、分化、信号传递、肿瘤转移、伤口愈合及细胞对机械压力的应激等生理病理过程。整合素α5(integrinα5，ITGA5)属于整合素超家族，其与整合素β1结合，形成异二聚体发挥生理功能。整合素α5β1是纤粘连蛋白（fibronectin，FN）的受体，两者结合后可触发信号转导过程，激活多种信号分子，从而参与细胞增殖、黏附、迁移、细胞骨架重建、胚胎发育等生理过程;最近有研究证实其在骨髓间充质细胞骨向分化中发挥作用。
　　 1998年有学者首次报道了ITGA5在人牙髓细胞的表达，并证实了其在细胞黏附过程中发挥作用。然而，目前关于ITGA5在hDPSCs的功能研究报道很少，本研究旨在对ITGA5在hDPSCs增殖、迁移、成骨/成牙本质向分化过程中的作用进行研究，为进一步阐明牙髓组织的损伤修复、再生机制提供理论依据。
　　 本论文分为以下三部分内容:
　　 第一章:hDPSCs的分离培养与鉴定
　　 本实验通过获取健康的年轻恒牙，利用组织块酶消化法分离培养hDPSCs，实验中组织块能较为牢固的贴附于培养瓶底，显微镜下观察组织块贴壁情况良好，培养的5～10d可见细胞从组织块内游出。传代扩大培养细胞贴壁性能良好，可进行稳定的传代，细胞呈梭形，胞质透光性好。对于所获细胞进行细胞表型与生物学特性检测，结果显示所获细胞可形成单细胞克隆，可成脂、成软骨、成骨诱导分化，流式细胞仪检测间充质细胞表面标记物为阳性，造血细胞来源表面标记物为阴性，证实为间充质来源。本实验成功分离了hDPSCs并传代扩大培养，为后续实验提供了可靠的细胞来源。
　　 第二章: ITGA5在hDPSCs增殖、迁移过程中的作用
　　 本实验通过构建抑制ITGA5表达慢病毒载体，感染hDPSCs，qRT-PCR与western blot检测ITGA5表达情况;利用MTT、EdU检测抑制ITGA5表达后hDPSCs增殖能力;利用Transwell检测人抑制ITGA5表达后hDPSCs迁移能力。结果显示利用抑制ITGA5慢病毒表达载体感染hDPSCs可获得较高的感染效率，qRT-PCR与western blot均表明ITGA5在hDPSCs表达量受到显著抑制;MTT、EdU检测结果显示抑制ITGA5表达后hDPSCs增殖能力显著降低;Transwell实验结果显示抑制ITGA5表达后hDPSCs迁移能力显著降低。
　　 第三章: ITGA5在hDPSCs成骨/成牙本质向分化过程中的作用
　　 本实验通过qRT-PCR检测ITGA5在经矿化诱导的hDPSCs与正常培养的hDPSCs中的表达情况。通过构建抑制ITGA5表达慢病毒载体，感染hDPSCs，矿化诱导21 d，茜素红染色显示抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs矿化结节形成情况;qRT-PCR检测抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs矿化诱导相关基因DSPP、DMP1、ALP、ON、OCN、BSP表达情况;通过westernblot检测DSPP在抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs矿化诱导21 d后表达情况。结果显示ITGA5在矿化诱导7 d hDPSCs中表达较正常培养的hDPSCs没有显著差异，矿化诱导14、21 d ITGA5表达下调;抑制ITGA5表达hDPSCs经矿化诱导后茜素红染色结节显著增多;qRT-PCR结果显示抑制ITGA5表达的hDPSCs矿化诱导相关基因DSPP、DMP1、ALP、ON、OCN、BSP较阴性对照组hDPSCs表达明显上调;western blot结果显示矿化诱导21 d后，抑制ITGA5表达hDPSCs的DSPP蛋白表达量较阴性对照组hDPSCs明显上调。
　　 材料与方法
　　 hDPSCs的分离培养
　　 南方医院口腔颌面外科收集18～25岁患者因阻生或正畸而拔除的健康的年轻恒牙（患者知情同意），牙齿拔除后立即置于完全培养基中送实验室，沿釉牙骨质界用高速手机环绕牙颈部磨出一定深度的沟槽。在超净台内将牙齿沿沟槽劈开，无菌条件下取出牙髓（去除根尖1/3的牙髓），置于PBS缓冲液内，漂洗至少3次。用眼科剪将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，I型胶原酶消化，悬液接种于6孔板，盖玻片固定，以低糖α-MEM、10％胎牛血清为培养基。37℃、5％ C02培养。将原代细胞以1～2个/孔的密度接种于96孔板内，37℃、5％C02培养14d，待出现细胞克隆后，传代扩大培养。
　　 克隆形成实验
　　 取第3代对数生长期的细胞，以100个/孔的密度接种于6孔板内，37℃、5％C02培养14d，待出现细胞克隆后，多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜下观察克隆形成情况（以＞50个细胞为一个克隆）。
　　 多向诱导分化
　　 取第3代对数生长期的细胞，以5×104/35mm培养皿接种，待细胞生长密度达70％时，分别加入成脂、成软骨、矿化诱导培养基，连续培养21 d，分别用油红0、阿利新蓝、茜素红染色，倒置显微镜下观察。
　　 流式细胞术检测细胞表面标记物
　　 取第3代对数生长期的细胞，1×105个重悬于含有0.1％ BSA预冷的PBS缓冲液中，用CD25、CD34、CD45、CD90、CD44、CD105抗体冰上避光敷育lh，含有0.1％ BSA预冷的PBS清洗，流式细胞仪检测标记物阳性率。
　　 qRT-PCR
　　 使用Trizol提取细胞的总RNA，逆转录成cDNA后，采用SYBR green法进行PCR扩增，通过相对定量法计算2-ddCt值，显示基因的相对表达情况。
　　 Western blot
　　 蛋白裂解液抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育、显影及定影。
　　 病毒获取
　　 设计合成抑制ITGA5表达的干扰shRNA序列，shRNA退火为双链DNA，HpaI和XhoI双酶切，连接PGC-LV慢病毒载体，lipofectamine2000转染PGC-LV、pHelperl.0、pHelper2.0三质粒系统入HEK-293T细胞，感染72 h后，收集上清，0.45μtm滤膜过滤。浓缩病毒液。
　　 细胞转染
　　 将慢病毒悬液按照不同的病毒感染复数感染正常hDPSCs，72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光（GFP标记）发光情况。筛选高效感染浓度。
　　 MTT
　　 将抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs以2×103/孔的密度接种于96孔板，ld、3d、5d、7d酶标仪测定490 nm波长下各孔OD值，统计分析。
　　 EdU
　　 将抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs以30％密度接种于35mm激光共聚焦培养皿，待细胞贴壁进入对数生长期后更换EdU标记的培养基培养6h后使用4％多聚甲醛进行细胞固定，2 mg/ml甘氨酸孵育，0.5％ Triton穿孔，Apollo染色，DAPI染色，激光共聚焦显微镜观察，获取图像，计算EdU标记细胞比例，统计分析。
　　 Transwell试验
　　 将抑制ITGA5表达的hDPSCs与阴性对照的hDPSCs接种于6孔板，待细胞密度达80％，更换无血清培养基，24 h后胰酶消化，上室使用无血清培养基，加入5×104个细胞，下室加入含10％FBS培养基，37℃、5％C02培养48 h，甲醇固定，0.1％结晶紫染色，细胞计数，统计分析。
　　 茜素红染色
　　 取对数生长期的细胞，矿化诱导21 d后，4％多聚甲醛固定20 min，茜素红染色10 min。倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。
　　 统计学分析
　　 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，结果以均值±标准差表示，采用两独立样本t检验进行显著性分析，设立检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1.成功分离培养hDPSCs
　　 本实验利用组织块酶消化法成功分离培养hDPSCs，所获得细胞具有克隆形成能力，成脂、成软骨、成骨能力，流式细胞检测其细胞表面标记物，CD29、CD44、CD90、CD105（间充质干细胞分子标志物）阳性表达率分别为90.82％、99.50％、98.79％、97.92％; CD34、CD45（造血干细胞分子标志物）阳性表达率为分别0.23％、0.75％。实验中细胞取材于人牙髓组织，具有克隆形成能力、多向分化潜能、且为间充质来源，为hDPSCs。
　　 2.ITGA5参与hDPSCs增殖、迁移过程
　　 本实验通过qRT-PCR、western blot验证成功构建抑制ITGA5表达慢病毒载体，并高效转染hDPSCs;设立ITGA5 shRNA group与scrambled shRNA group。MTT结果显示ITGA5 shRNA group的hDPSCs在3、5、7d较scrambled shRNAgroup细胞增殖数量显著降低（P＜0.01），EdU结果显示ITGA5 shRNA group的EdU阳性标记hDPSCs数量较scrambled shRNA group显著降低(P＜0.01);ITGA5 shRNA group的hDPSCs穿孔数量较scrambled shRNA group hDPSCs显著降低（P＜0.05）。
　　 3.ITGA5在hDPSCs成骨/成牙本质向分化中的作用
　　 设立正常对照组(Growth medium)与矿化诱导组(Mineralization medium)，分别正常培养与矿化诱导21 d，qRT-PCR结果显示矿化诱导组hDPSCs与正常培养组hDPSCs ITGA5表达量第7d无明显变化(P＞0.05)，在第14、21d矿化诱导组ITGA5表达量较正常培养组降低(P＜0.05)。通过构建慢病毒表达载体抑制ITGA5在hDPSCs的表达，设立ITGA5 shRNA group与scrambled shRNA group。矿化诱导21d后，茜素红染色显示ITGA5 shRNA group矿化结节显著多于scrambledshRNA group(P＜0.01);qRT-PCR结果显示ITGA5 shRNA group较scrambledshRNA group矿化诱导相关基因DSPP、DMP1、ALP、ON、OCN、BSP表达明显上调(P＜0.01);western blot结果显示矿化诱导21d后，ITGA5 shRNA group的DSPP表达量明显上调。
　　 结论
　　 1.利用组织块酶消化法成功分离培养hDPSCs，所获细胞间充质干细胞表型与生物特性，证实为hDPSCs。
　　 2.成功构建抑制ITGA5表达慢病毒载体并高效感染hDPSCs;抑制ITGA5在hDPSCs表达，可显著降低hDPSCs增殖、迁移能力。
　　 3.矿化诱导后期，ITGA5在hDPSCs表达下调;抑制ITGA5在hDPSCs表达，可显著促进hDPSCs成骨/成牙本质向分化。

目录

摘要

前言

第一章 人牙髓干细胞的分离培养与鉴定

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二章 ITGA5在KDPSCs增殖、迁移过程中的作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第三章 ITGA5在hDPSCs成骨／成牙本质向分化过程中的作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

英文缩略词

成果

致谢

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