兔脑栓塞急性期体外循环脑保护的基础研究

摘要

研究背景： 我国第三次国民死因调查结果表明，脑血管病已经升为中国第一位死因，占死亡总数的22.45％。而在脑血管病中，缺血性脑卒中（脑栓塞或脑梗塞）占了80％。并且有研究表明，30％以上的病因是由心脏病导致。来自心脏的血栓或赘生物随着血循环进入大脑内的动脉，造成该供血区域的组织缺血，出现神经功能障碍。这些导致脑栓塞的心脏疾病往往需要在体外循环（Cardiopulmonary bypass，CPB）下进行心脏手术，清除附壁血栓或瓣膜上的赘生物，或进行心脏瓣膜置换，或修复先天性畸形，方可解决再栓塞的问题。而目前体外循环技术的运用使心脏手术术后病死率显著下降，但术后神经系统并发症却居高不下。因体外循环的控制性低血压、血液稀释、非生理性转流，以及可能产生的微栓塞和炎症反应，最终都会加重脑损伤。为降低体外循环造成的脑损伤，传统的预防或治疗方法是通过加强术中监护、减少手术栓塞、降低炎症反应强度、增强脑组织对缺血缺氧耐受能力等综合措施进行干预。但其效果仍不理想。 针对脑栓塞这一特定病理条件下，我们知道栓塞本身就已经对脑组织造成严重的损伤，特别是在急性期。而在此期间，CPB的低温在一定程度具有脑保护作用。CPB过程中有常温(37℃)、中低温(28-32℃)及深低温(18-27℃)这三种常用温度。因低温在急性局灶性和全脑缺血实验模型中具有一定的神经保护作用。尽管其机制尚待完全阐明，但低温能影响脑缺血过程的多种病理生理学机制。局灶性脑缺血时，低温通过延缓或阻断缺血性细胞死亡的发生，发挥其神经保护作用。如能及时恢复灌注，仍可恢复正常。近年来发现，低温的神经保护作用远远超出了其降低氧和葡萄糖代谢需求的能力。低温还能减轻有害的细胞内蛋白水解反应、血脑屏障受损、炎症级联反应以及氧自由基的产生和释放。此外，低温可减少兴奋性神经递质（如谷氨酸）的释放，从而减轻其对周围神经元的损伤。同时，在主动脉弓部手术中为减少脑组织的损害，采取低温的方法，也取得良好的脑保护效果。 同时，在脑损伤及低温CPB情况下，血脑屏障的开放对治疗药物进入脑细胞创造了良好的环境。其中，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经系统重要的生物活性分子之一，它本身是一种调节因子，影响着中枢神经系统某些神经元的存活和分化，可以促进神经元的成熟和修复、维持神经细胞生存和行使机能，在病理状态下可挽救缺血损伤的神经元细胞。近年来的一些研究发现脑组织缺血损伤后，可见到NGF在脑组织中表达增多，且对脑缺血损伤有一定的保护和治疗作用。有实验结果表明外源性NGF处理对深低温停循环后神经细胞凋亡有抑制作用，能明显减轻脑缺血再灌注引起的神经细胞的凋亡，从而起到脑保护作用。一般情况下NGF不易通过血脑屏障，但是在低温CPB情况下，血脑屏障通透性增加，NGF可以通过血脑屏障在脑组织中达到较高的浓度，从而发挥有效的脑保护作用。 临床研究已证实，脑损伤可致甲状腺素水平异常的现象。当脑损伤合并低甲状腺素的病人其受伤机制一般较复杂，原发脑损伤较重，因而预后较差。甲状腺素水平变化与颅脑损伤的预后也确实存在联系，其中，颅脑损伤合并低甲状腺素的病人，其预后明显比无合并低甲状腺水平病人差，其原因可能与颅脑损伤造成的下丘脑—垂体—甲状腺轴功能异常，从而加剧脑损伤有关。体外循环心脏手术围手术期甲状腺功能受到一定的抑制，可引起三碘甲状腺原氨酸(T3)降低，对患者术后机体的恢复产生一定的影响。围手术期适当补充甲状腺素片，可促使血清T3快速恢复正常，减少术后正性肌力药物和血管活性药物的用量。并可减轻脑损伤，促进神经系统功能的恢复。 我们前期的研究已经成功建立了兔脑栓塞急性期体外循环的模型，并证实了脑栓塞后24小时与1周行体外循环术，均未出现新的栓塞病灶或出血灶，揭示了脑栓塞急性期行体外循环心脏手术并非绝对禁忌症，所面临的风险或在可接受范围内。并在实验中发现:体外循环脑损伤的机制、机体炎症反应以及脑血管舒缩功能的改变密切相关。 本研究拟深入探讨在兔脑栓塞急性期行CPB手术，从控制CPB过程中的温度以及预充液中加入外源性药物进行干预等方面，观察其脑保护的效果，有望对脑栓塞急性期CPB的脑保护提供更新的理论及方法，从而更好地在手术中保护神经功能。 第一章中低温对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用 目的: 1.在脑栓塞急性期的特定条件下，通过恒温水箱控制体外循环过程中的温度，观察何种温度条件下脑保护的效果最好。 材料和方法: 1.实验动物及分组:24只成年健康新西兰白兔，体重2.0～2.5kg，平均2.3±0.45Kg，由南方医科大学南方医院动物中心提供。采用完全随机设计方法所有动物兔随机等分为三组，每组8只。A组为脑栓塞24h后行体外循环术（术中常温，37℃）、B组为脑栓塞24h后行体外循环术(术中中低温，28℃)、C组为脑栓塞24h后行体外循环术（术中深低温，20℃）。 2.建立兔脑栓塞急性期体外循环模型:A、B、C三组均经眶上缘入路，直视下凝断左侧大脑中动脉主干，建立兔大脑中动脉脑栓塞模型。神经功能测定:麻醉清醒后按5分制评分标准进行评分:0分，无神经系统症状;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，爬行时转圈，3分，向对侧倾倒;4分，不能自行行走，意识丧失。评分为1～3分的入选。入选的实验兔在接受经眶上缘入路大脑中动脉凝断术24h后，胸骨正中切口开胸，升主动脉和右心房分别缝荷包线，升主动脉插灌注管，右心房插引流管。固定插管后，打开各个通路，开始转流，并通过恒温水箱分别降至目标温度[A组（常温，37℃）、B组（中低温，28℃）、C组（深低温，20℃）]。主动脉阻断后，由主动脉根部注入停跳液20ml，实现心脏停跳，建立体外循环，术中监测心率、体温、有创血压。1小时体外循环结束后，开放主动脉根部，复温、辅助循环及撤除体外循环。 3.标本采集及指标检测:分别在兔体外循环前、体外循环20min后和体外循环60min后采取兔静脉血3ml，1小时内用3000转/分钟离心30分钟，使用不含热原和内毒素的试管取上清液，标号后，在-20℃的冰箱内保存。24小时后采用ELISA法测定测定血浆中S100β蛋白、肿瘤坏死因子(TNF-α)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及一氧化氮(NO)含量。 4.数据分析:采用SPSS13.0.0软件进行统计分析，数值采用均数±标准差((x)±SD)表示，图表中数据采用均数及标准差（SD）或95％可信区间(CI)表示。组间比较采用方差分析(ANOVA)法计算F值，两两比较采用LSD-t检验;组内不同时间点连续性数据比较采用wilcoxson秩和检验，离散型数据采用Fisher's精确检验。P值小于0.05为具有统计学差异。 结果： 1、脑损伤生化指标:血浆S-100β蛋白是发现早期脑损伤的有效标记物，血浆髓鞘碱性蛋白(MBP)含量的变化可以从生化指标来反映脑实质损害与血脑屏障破坏的程度。常温组及深低温组的S-100β、MBP的浓度在体外循环20min及体外循环60min后较中低温组显著升高(P＜0.05)，术前三组比较无差别; 2、炎症反应指标:TNF-α参与创伤后血管源性脑水肿的形成，血脑屏障的破坏，以及神经元的变性、坏死。常温组及深低温组的TNF-α的浓度在体外循环20min及体外循环60min后较中低温组显著升高(P＜0.05)，术前三组比较无差别; 3、血管内皮舒张因子:NO是强效的血管扩张剂，有利于保护脑血管的舒缩功能。常温组及深低温组血浆中的NO浓度在体外循环20min及体外循环60min后较中低温组显著降低(P＜0.05)，术前三组比较无差别。 结论:在脑栓塞急性期这样一特定条件下，通过恒温水箱，将体外循环过程中的温度控制在低温(28℃)下，可明显减轻脑损伤、抑制炎症反应以及在一定程度上维持脑血管的舒缩功能，从而起到较好的脑保护效果。 第二章外源性神经生长因子对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用 目的: 1、在脑栓塞急性期的特定条件下，CPB术中给予外源性神经生长因子，观察其脑保护的效果。 材料和方法: 1、实验动物及分组:16只成年健康新西兰白兔，体重2.0～2.5 kg，平均2.3±0.45Kg，由南方医科大学南方医院动物中心提供。采用完全随机设计方法所有动物兔随机等分为两组，每组8只。D组（非治疗组）和E组（治疗组）。 2、建立兔脑栓塞急性期体外循环模型的方法步骤基本同前。注:以心脏手术最常用的中低温(28℃-32℃)作为温度控制标准，在E组CPB的预充液中加入“注射用鼠神经生长因子”，2mL(40 mg)。D组中以2mL的生理盐水作为对照。 3、标本采集及指标检测:分别在兔体外循环前、体外循环20min后和体外循环60min后采取兔静脉血3ml，1小时内用3000转/分钟离心30分钟，使用不含热原和内毒素的试管取上清液，标号后，在-20℃的冰箱内保存。24小时后采用ELISA法测定血浆中S100β蛋白、肿瘤坏死因子(TNF-α)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及一氧化氮(NO)含量。 4、数据分析:采用SPSS13.0.0软件进行统计分析，数值采用均数±标准差((x)±SD)表示，图表中数据采用均数及标准差（SD）或95％可信区间（CI)表示。组间比较采用t检验。P值小于0.05为具有统计学差异。 结果： 1、脑损伤生化指标:非治疗组的S-100β蛋白浓度在体外循环20min及体外循环60min后较治疗组显著增高(P＜0.05);而MBP的浓度在不同时间点，两组无显著差异(P＞0.05); 2、炎症反应指标:非治疗组的TNF-α浓度在体外循环20min及体外循环60min后较治疗组显著增高(P＜0.05); 3、血管内皮舒张因子:非治疗组血浆中的NO含量在体外循环20min及体外循环60min后较治疗组显著下降(P＜0.05)。 结论: 在脑栓塞急性期体外循环过程中，通过给予外源性神经生长因子，可明显减轻脑损伤、抑制炎症反应以及在一定程度上保护脑血管舒缩功能，从而起到较好的脑保护效果。 第三章甲状腺激素对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用 目的: 1、针对脑栓塞急性期的这种特定条件，CPB的预充液中加入外源性甲状腺激素，观察其脑保护的作用。 材料和方法: 1、实验动物及分组:16只成年健康新西兰白兔，体重2.0～2.5kg，平均2.3±0.45Kg，方医科大学南方医院动物中心提供。采用完全随机设计方法所有动物兔随机等分为两组，每组8只。F组为生理盐水组（对照组）、G组为甲状腺素组（处理组）。 2、建立兔脑栓塞急性期体外循环模型的方法步骤基本同前。注:以心脏手术最常用的中低温(28℃-32℃)作为温度控制标准，在CPB的预充液中加入“甲状腺素针剂（钠盐）”，3ml(1mg/10ml)。对照组预充液中加入等量的生理盐水。术中进行心率、体温、有创血压的监测。 3、标本采集及指标检测:分别在兔体外循环前、体外循环20min后和体外循环60min后采取兔静脉血3ml，1小时内用3000转/分钟离心30分钟，使用不含热原和内毒素的试管取上清液，标号后，在-20℃的冰箱内保存。24小时后采用ELISA法测定血浆中S100β蛋白、肿瘤坏死因子(TNF-α)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及一氧化氮(NO)的含量。 4、数据分析:采用SPSS13.0.0软件进行统计分析，数值采用均数±标准差（(x)±SD）表示，图表中数据采用均数及标准差（SD）或95％可信区间（CI)表示。采用t检验。P值小于0.05为具有统计学差异。 结果： 1、脑损伤生化指标:对照组的S-100β蛋白、MBP浓度在体

目录

摘要

前言

第一章 中低温对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二章 外源性神经生长因子对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

2 讨论

5 结论

第三章 甲状腺激素对兔脑栓塞急性期体外循环的脑保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

全文总结

综述 体外循环对脑血管影响的研究进展

附录(图)

中英文对照与缩写

攻读硕士学位期间成果

致谢

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