KLF1突变的人群遗传学研究及对β地中海贫血临床表型严重性的遗传修饰作用

摘要

背景与目的:
　　本次研究首次通过分子筛查一个大样本中国人群来调查KLF1基因的突变率与突变谱，并通过表型研究来评估KLF1突变是否对β地贫具有遗传修饰作用。
　　设计与方法:
　　一、研究人群、病人和表型检测
　　本研究通过随机抽样对长期居住在中国南方地区的3918例非亲缘关系个体进行了突变分析，这个大人群队列包括:3839例连续采集的样本和79例表型导向型样本（Hb A2水平:3.3％-4.1％和/或Hb F水平大于1.5％）。与此同时，我们通过采集携带KLF1突变的β地贫患者进行了家系研究，以确认突变是自发突变还是遗传性突变。另外，我们还召集了中国非地贫高发区域的1190例个体作为对照研究，他们来自中国北方地区山东省。
　　所有的血液学参数均用自动血细胞计数仪测定，血红蛋白组分分析运用高效液相色谱法进行测定。红细胞表面抗原CD44表达量运用流式细胞仪分析。
　　二、分子遗传检测
　　DNA提取采用传统的酚/氯仿抽提法。通过高分辨率熔解曲线技术分析（HRM assay）筛查所有参加者的KLF1变异，运用第一代测序对所筛查的变异进行验证。对于KLF1变异是否是功能性突变主要基于两点标准:(1)根据表型的变化:携带者Hb F水平大于1％同时/或红细胞表面抗原CD44表达下降;(2)生物信息学预测:应用 SIFT(http://sift.jcvi.org)和 PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)软件来预测所发现的KLF1变异是否影响其蛋白质结构和功能。
　　三、统计分析
　　所有的统计分析均使用SPSS19.0统计软件或R语言进行，P＜0.05视为具有显著的统计学差异。
　　结果:
　　一、中国南方地区人群具有相对高的KLF1突变率
　　中国南方人群KLF1突变率在队列A，队列B，队列C的突变率分别是:1.27％(25/1971)，1.16％(11/946)，1.30％(12/922)，且这三组之间没有统计学差异，P=0.959，但南方人群KLF1总突变率显著高于北方人群(1.25％ vs.0.08％，P＜0.001)，说明KLF1突变在中国南方人群有相对高的突变频率，且在地中海贫血流行区域更为常见。
　　二、广泛的KLF1突变谱
　　3839例连续采集的南方人群样本（队列A，B，C）中共鉴定出48个突变的KLF1等位基因，79例表型导向型样本共发现16个，检出率为20.25％。从突变谱看，p.Gly176AlafsX179和p.His299Asp为最主要的两种突变，占所有突变的90.6％。另外本研究还报道了13种新的中性KLF1变异，包括4种错义突变、4种同义突变和5种3'UTR突变。所发现的这些突变首次展现了KLF1基因人群广泛的突变谱。
　　三、KLF1突变可改变正常个体血液学参数
　　通过对41例携带KLF1突变的非地贫人群（25例来自队列A，16例来自队列D）进行血液学分析，发现无论是平均红细胞体积(Mean corpuscular volume，MCV)还是平均红细胞血红蛋白量（Mean corpuscular hemoglobin，MCH）与1946例未携带KLF1突变的非地贫人群相比都轻微的降低了(MCV:82.45±5.39 vs.89.29±4.77 fL,P＜0.001; MCH:26.95±2.11 vs.29.46±1.44 pg,P＜0.001)。另外，这41例个体的Hb A2和Hb F水平也有一定程度的升高，分别为3.28±0.45％和3.44±1.75％。因此，本研究首次通过人群研究发现轻微升高或者处于临界值的MCV和MCH是KLF1基因突变的重要表型，与升高的Hb A2和Hb F这两个已发现的指标一样，可以提高筛查KLF1基因突变的阳性率。
　　四、KLF1突变可改变β地贫携带者的血液学表型
　　本研究对14例KLF1杂合突变与β0杂合突变共遗传的个体进行了血液学分析，其中7例β0/βN来自队列B（队列B中1例β+/βN，1例βE/βN，2例β0/βN合并α地贫被排除分析），另外7例β0/βN来自家系样本。意外的是，这14例个体MCV或MCH与217例β0杂合突变携带者相比，并未显得更低，无统计学差异(MCV:63.53±3.94 vs.65.11±4.34 fL，P=0.112; MCH:20.26±1.42 vs.20.34±1.37 pg，P=0.567)。另外一方面，这14例个体显示出了相当高的Hb A2(α262)水平（6.47±0.81％，最低5.10％，最高8.00％），显示出KLF1突变和β-globin基因突变对δ-globin基因表达升高的叠加作用;与此同时，我们注意到这些样本具有升高的且变异的Hb F水平（7.67±4.11％，最低3.60％，最高18.20％），但其变异性有待进一步研究。
　　五、KLF1突变可减轻β地贫患者临床表型严重性
　　为了评价KLF1突变对β地贫患者临床表型的修饰作用，我们全面研究了922例β地贫患者的临床表型和目前已知的潜在的减轻β地贫患者临床表型的遗传因素。我们意外的发现2种KLF1突变选择性的出现在12例中间型β地贫患者(TI)中（其中10例携带p.Gly176AlafsX179，2例携带p.His299Asp）。通过Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards model)对8个潜在修饰因素进行评估结果显示，KLF1基因突变对β地贫患者临床表型修饰作用最大(HR=0.213，P＜0.001)，其次是HBB基因型(β+，HR=0.353，P＜0.001)，XmnI(+，HR=0.512，P＜0.001)，HBA突变（HR=0.671，P＜0.001），rs9399137(HR=0.724，P＜0.001) rs766432（HR=0.761，P＜0.001），但性别因素(HR=0.893，P=0.107)和rs11886868（HR=0.871，P=0.415）这2个因素被模型排除。12例TI的基因型中7例是β0/β0+αα/αα，3例β0/β++αα/αα，2例β0/β0+—SEA/αα，我们通过单因素分析[β0/β0，αα/αα，XmnI(-/-)，rs766432(AA or AC)，rs9399137(TT or CT)]比较7例携带KLF1突变和362例无KLF1突变的β地贫患者临床表型，结果显示这7例β地贫患者表现出相对轻的临床表型:较高的Hb水平(82.57±7.81 vs.66.33±17.53 g/L，P=0.006)，较高的Hb F水平（39.58±21.80 vs.9.17土11.05 g/L，P＜0.001），相对少的输血次数（OR=0.082，P=0.007）和较低的TM风险率(OR=0.009，P＜0.001)。Kaplan-Meier无输血生存曲线显示出显著的差异存在这两组中（P＜0.001），其第一次输血的中位时间分别是36个月和6个月。另外，所有携带12例KLF1突变的TI第一次输血的中位时间是48个月，而922例β地贫患者人群中的342例非携带KLF1突变的TI第一次输血的中位时间是24个月，但统计学并未显示出两者间具有差异(P=0.093)，显示出两组TI具有一定的同质性。
　　结论:
　　一、本研究首次设计人群遗传学大样本的研究调查出KLF1基因突变在中国南方和中国北方地区的人群突变率，证明KLF1基因突变在地中海贫血流行区域更常见(1.25％ vs.0.08％)。与此同时，鉴定出的64个KLF1突变全面的展现出中国人群广泛的KLF1突变谱。
　　二、首次通过对携带KLF1突变的非地贫样本和β杂合子样本的基因型与表型样的分析，系统阐明了KLF1突变可以引起MCV和MCH轻微降低或处于临界值，Hb A2水平和HbF水平升高;功能性突变可以使红细胞表面抗原CD44表达降低。这些变异的表型有助于KLF1突变的人群筛查。
　　三、应用Cox比例风险回归模型全面系统的评估了包括KLF1突变在内的8个因素对922例β地贫患者的临床表型修饰作用，发现KLF1突变可以减轻β地贫患者的临床表型且影响作用最强，对精确诊断β地贫、产前诊断、遗传咨询和基因诊断方面提供了重要依据和线索。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 β地中海贫血及临床表型多样性

1．2 数量性状位点控制的Hb F水平调节

1．3 红系转录因子KLF1

第2章 实验材料

2．1 主要仪器

2．2 分析软件和数据库

2．3 相关试剂

第3章 实验方法

3．1 人群设计

3．2 样本收集

3．3 β地贫病例临床表型分类标准

3．4 本研究技术路线图

3．5 表型分析

3．6 外周血基因组DNA提取

3．7 HBA和HBB突变分析

3．8 KLF1突变分析

3．9 Hb F表达相关SNPs分型

3．10 双抗体夹心ELISA法检测ζ-珠蛋白表达检测

3．11 统计学分析

第4章 实验结果

4．1 南方人群具有相对高的KLF1突变率

4．2 KLF1广泛的突变谱

4．3 KLF1突变可改变正常个体血液学参数

4．4 KLF1突变可改变β地贫携带者的血液学参数

4．5 KLF1突变可减轻β地贫患者临床表型严重性

第5章 讨论

结论

参考文献

附录

统计学审稿证明

硕博攻读期间发表论文

致谢

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