PTEN通过负调节PI3K/AKT信号通路下调内皮素受体B抑制内皮素-1引起的肝星状细胞活化

摘要

目的：肝纤维化是继发于各种慢性肝脏疾病之后反复的创伤愈合与瘢痕修复过程，其主要病理生理学特征是细胞外基质(Extrcellular matrix，ECM)的生成与降解失衡，引起ECM的大量沉积，最终导致肝纤维化。为了进一步探讨ET-1及PTEN在HSCs激活方面的作用，本实验通过研究过表达PTEN的HSC-T6在外源性ET-1的刺激下所产生的效应，并应用PI3K/AKT信号通路的特异性抑制剂LY294002模拟PTEN对PI3K/AKT信号通路的阻断作用，探讨PTEN是否能够通过负调节PI3K/AKT信号通路下调ETBR的表达从而抑制ET-1引起的HSCs的激活。
　　方法：①、实验分组
　　本实验按以下分组方式进行:1、P组，PTEN转染HSC-T6+ET-1组;2、 V组，空载PTEN的vector转染HSC-T6+ET-1组;3、PB S+ET-1空白对照组;4、L+V组，空载PTEN的vector转染HSC-T6+ET-1+LY294002组;5、PB S+ET-1+LY294002组。
　　②、细胞培养
　　大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自广东科学院，细胞培养在含10％胎牛血清、100 IU/m青霉素、和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，并在37℃含5％CO2的培养箱中孵育。
　　③、细胞瞬时转染
　　在转染前24小时，指数级生长的HSC-T6以每孔2×105的浓度接种于6孔板，待细胞铺满70％-80％的培养孔时开始转染。PTEN及空载PTEN的vector采用lipofectamine2000，根据试剂盒说明，以最终100nM的浓度转染进入HSC-T6，并设置PBS为空白对照组。转染稳定后各组加入10-7mol/L ET-1，12h在L+V组及L+PBS组加入50uM/L LY294002，ET-1作用48h后检测各指标的蛋白质及基因水平的表达。
　　④、蛋白质免疫印迹法(western blot)
　　α-SMA,ETBR及ETAR的蛋白表达水平采用western blot方法检测。经ET-1作用48h后，收集细胞样品，加入相应体积的含有1％ Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，冰上放置30 min，然后4℃，12000 r/min离心10 min，吸出上清，得到总蛋白样品。样品蛋白质采用BCA蛋白定量试剂盒定量。调整样品蛋白质浓度使其接近，保证每个样品孔蛋白质上样量一致.蛋白质经10％ SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5％脱脂奶粉封闭1h后，加入一抗4℃过夜。在此过程中所用到的抗体α-SMA(1;1000 dilution，Santa CruzInc), ETBR(1∶1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR(1;1500 dilution; Santa CruzInc), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)(1∶1000 dilution;Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜，经洗涤后，再加入HRP标记的二抗(1∶4000 dilution，Fude Biotech)，室温下孵育1h。每步反应结束均用PBST洗涤3次，每次10 min。最后用ECL化学发光3-5min，使用Odyssey成像系统扫膜。结果以目的蛋白与GAPDH吸光度的比值表示。
　　⑤、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
　　ET-1作用后48h，采用Trizol（Invitrogen）试剂盒，按说明提取细胞总RNA。将RNA提取物1ug，逆转录为cDNA，并置于-80℃保存备用。建立20ul的PCR反应体系包括:cDNA，上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler480IISystem进行PCR扩增，建立最适的PCR反应体系，扩增相应的产物。β-actin被用作内参。ETAR引物序列:上游5'-TCTGATGACCTCGGTCCC-3'，下游5'-GTTCATGC TGTCCTTATGGCT-3'，ETBR引物序列:上游5'-AATTACGAT GGA CTAC AAA GG AAG TT A-3'，下游5'-GCAAGCAGAAATAGAAACTGAATAGC-3'.β-actin引物序列:上游5'-TCACCCACACTGTGCCC ATCTACGA-3'，下游5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'。
　　所有数据以均数±标准差((x)±s)表示。采用SPSS21.0软件进行统计分析。组间均数差异性比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：1、ET-1作用后各组各指标的变化
　　①、ET-1作用后各组α-SMA的表达变化
　　Western blot检测结果显示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各组HSC-T6后，P组α-SMA的相对表达量为(0.35±0.01)，明显低于V组（0.46±0.01）及PBS组（0.46±0.01）(p＜0.05)，差异有统计学意义。
　　②、ET-1作用后各组ETBR的表达变化
　　Western blot检测结果显示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各组HSC-T6后，ETBR蛋白的相对表达量在P组为(0.42±0.01)显著低于V组（0.85±0.01）及PBS组(0.83±0.01)，(p＜0.05)，差异有统计学意义。qRT-PCR结果显示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各组细胞后，ETBR mRNA的相对表达量在P组为(0.63±0.06)显著低于对照组（V组:1.61±0.13，PBS组:1.50±0.03）(p＜0.05)，差异有统计学意义。
　　③、ET-1作用后各组ETAR的表达变化
　　Western blot检测结果显示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各组HSC-T6后，ETAR蛋白的相对表达量在P组为(0.22±0.01)与V组(0.22±0.01)及PBS组(0.22±0.01)无明显差异。qRT-PCR结果显示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各组细胞后，ETAR mRNA的相对表达量在P组为(0.46±0.01)，V组(0.46±0.01)，PBS组(0.46±0.01)，(p＞0.05)，各组之间差异无统计学意义。
　　2、LY294002作用后各组各指标的变化
　　①、LY294002作用后各组α-SMA的表达变化
　　Western blot检测结果显示，LY294002作用于各组HSC-T6后，α-SMA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.34±0.01，0.34±0.01)，显著低于V组及PBS组α-SMA的表达(p＜0.05)，但与P组α-SMA的表达无显著差异(p＞0.05)。
　　②、LY294002作用后各组ETBR的表达变化
　　Western blot检测结果显示，LY294002作用于各组HSC-T6后，ETBR蛋白的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.43±0.01，0.44±0.01)，显著低于V组及PBS组(p＜0.05)，但与P组ETBR蛋白的相对表达无显著差异(p＞0.05)。qRT-PCR结果显示，ETBR mRNA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.65±0.02，0.64±0.01)，显著低于V组ETBR mRNA的表达(p＜0.05)，但与P组ETBR的表达无显著差异(p＞0.05)。
　　③、LY294002作用后各组ETBR的表达变化
　　Western blot检测结果显示，LY294002作用于各组HSC-T6后，ETAR蛋白的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.22±0.02，0.23±0.01)，与P组、V组及PBS组ETAR蛋白的相对表达量无明显差异(p＞0.05)。qRT-PCR结果显示， ETAR mRNA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.45±0.02，0.46±0.01)，与P组、V组及PBS组ETAR mRNA的相对表达量无明显差异(p＞0.05)。
　　结论：PTEN通过负调节PI3K/AKT信号通路下调ETBR而非ETAR的表达从而抑制ET-1引起的HSCs的活化。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 方法

2．3 PTEN转染HSC-—T6

2．4 蛋白质免疫印迹法

2．5 实时荧光定量PCR(Real—time Q—PCR)

2．6 统计学处理

第三章 结果

3．1 转染效率检测

3．2 ET—1作用于HSC—T6后α—SMA的表达

3．3 ET—1作用后HSC—T6表面ETBR的表达

3．4 ET—1作用后HSC—T6表面ETAR的表达

3．5 LY294002作用后各组α—SMA的表达

3．6 LY294002作用后各组ETBR的表达

3．7 LY294002作用后各组ETAR的表达

第四章 讨论

参考文献

中英文对照缩略词表

综述

硕士期间发表的论文

致谢

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