抗核抗体及抗双链DNA抗体荧光免疫层析法快速筛查试剂盒的研究

摘要

目的:本课题在当今检验医学发展提出的POCT(PointOf Care Testing)，即即时检验新领域背景下，致力于开发一种新的检测试剂即荧光免疫层析快速检测试剂盒，使用小型荧光免疫分析仪进行检测，花费时间在15分钟左右，因此简单、便捷，标本即到即检，既能解决病人等待时间长之问题，又能解决临床医生执行自身免疫性疾病临床诊断的路径问题，可以在各级医院临床推广使用，以提高自身免疫疾病的诊治水平。
　　荧光免疫层析检测法是一种将免疫侧向层析技术、链霉亲和素-生物素放大系统和荧光检测技术三者结合起来的一种检测技术，该技术首次将荧光蛋白作为其标记物并结合了链霉亲和素-生物素放大系统，不仅提高了快速检测的稳定性也提高了试剂检测的灵敏性。同时检测速度快，整个分析过程只需要十五分钟左右。这种技术是课题组的多项专利技术融合，将它用于抗核抗体的快速筛查检测试剂盒的研发，可以填补抗核抗体的快速筛查领域中的空白。
　　综上所述，本课题拟采用荧光免疫层析法用荧光免疫分析仪来检测血清标本中ANA及dsDNA，开发快速检测试剂盒，可用于AID的早期筛查和病情监控。
　　方法:1、抗原的制备、纯化、鉴定及固化
　　1.1、抗原制备、纯化、鉴定:
　　根据自身免疫性抗原自身特点采取有效的方法（如基因工程合成、质粒提取DNA等）制备抗原，纯化后利用商品化的单克隆抗体检测试剂盒和确诊为相关自身免疫疾病且ANA或dsDNA阳性的血清进行验证，以验证制备的抗原是否合格，然后进一步纯化浓缩，保证靶抗原的丰度与纯度。最后鉴定经过纯化浓缩处理后的抗原是否符合进一步研究的要求。
　　1.2、抗原固化:
　　以PBS缓冲液系统稀释提取抗原至合适浓度，固定于NC膜上;加入待测不同稀释度的阳性标本，根据荧光强度调整缓冲液成分。对固化过程中的环境条件，分别在湿度45％、50％、55％和60％进行，以划线粗细均匀，无明显扩散、无明显疏水斑为佳;在稳定性能上，分别保存1、3、5、7、10天，用阳性标本检测比较荧光强度。
　　2、荧光蛋白与抗体的结合
　　生物素标记鼠抗人IgG抗体:用PBS溶液将待标记抗体稀释至相应浓度，放入适当的离心管中;DMF将生物素溶解至相应浓度，加入待标记抗体中，充分反应后，根据反应体系大小，加入一定量的0.1M的NH4Cl，终止标记。4℃透析除去多余的生物素和NH4Cl，透析好的标记抗体放入-20℃长期保存，或4℃保存近期实验备用。
　　链霉亲和素标记荧光蛋白:从GeneBank中调取链霉亲和素基因sa、藻蓝蛋白β亚基cpcB、裂合酶基因alr0617、藻红胆素合成酶基因ho1、pebA和pebB的序列，设计引物，以藻总DNA作为模板进行PCR扩增获取目的片段转入质粒，选择同时携带链霉亲和素与蓝藻蛋白cpcB的融合基因，以及Histag标签。通过培养含有质粒的大肠工程菌，进行融合蛋白的表达，鉴定及纯化，获取链霉亲和素标记荧光蛋白。
　　荧光蛋白与抗体结合能力检测:将生物素标记鼠抗人IgG抗体包被在96孔板，加入一定浓度的链霉亲和素标记荧光蛋白，通过微孔板检测仪检测荧光强度检测链霉亲和素标记荧光蛋白与鼠抗人IgG抗体结合能力。
　　3、测试卡的制备及组装
　　(a)样品垫，以玻璃纤维膜为载体，经样品垫处理液浸泡处理，烘干;(b)荧光蛋白结合垫，以玻璃纤维膜为载体，经结合垫处理液浸泡处理，烘干，将荧光蛋白经缓冲液稀释后，均匀喷在纤维膜上，烘干;(c)生物素化鼠抗人IgG抗体结合垫，以玻璃纤维膜为载体，经结合垫处理液浸泡处理，烘干，将生物素化鼠抗人IgG抗体经缓冲液稀释后，均匀喷在纤维膜上，烘干;(d)NC膜，结合有检测用固相抗原（检测线T）和质控用IgG抗体（质控线C;本研究dsDNA系统用羊抗兔IgG、ANA系统用羊抗鼠IgG），分别将抗原和羊抗兔（鼠）IgG抗体经缓冲液稀释后，用划膜仪均匀划至NC膜上，烘干;(e)吸水垫(f)底板，PS底板，带有不干胶，作为各成分粘贴的载体;上述(a)-(e)组分按顺序和层叠次序粘贴于PS底板上，切为4mm宽条状，得到测试条;(g)卡壳:依据测试条的组分分布设计模具，塑料成型制成卡壳;将测试条装入其中，完成测试卡制备。
　　4、试剂盒反应条件优化及性能评价
　　通过优化筛选合适的抗原抗体，优化抗原抗体反应浓度、反应时间、缓冲液体系、加样体积等参数，提高试剂盒准确性、精密度、灵敏度、特异性和稳定性，并形成稳定的生产工艺。对试剂盒进行性能评价，主要指标为:线性范围、精密度、灵敏度、特异性和稳定性。通过现有检测方法和研制的快速筛查测试卡检测结果相比较，评价结果的一致性，评价抗核抗体快速筛查试剂盒的临床使用效果。
　　结果:1、抗ds-DNA抗体检测试剂盒研制开发
　　1.1、生物素标记dsDNA抗原(Biotin-dsDNA)的制备:选择pGEM-T载体，pb3433，用LB培养基培养18h集菌后用碱裂解法提取其质粒DNA。使用限制性核酸内切酶将dsDNA切成具有粘性末端（游离氨基-NH2）的线性dsDNA，按照5mg/mL生物素酰肼水溶液∶5％戊二醛∶dsDNA水溶液=5∶6∶10比例混合搅匀，通过化学交联剂把活化的BSA与具有游离氨基的线性dsDNA连接，形成dsDNA-BSA包被抗原。
　　1.2、荧光探针制备:选择Merck Millipore Corporation公司的荧光微球，完成鼠抗人IgG与荧光微球偶联优化，最终确定将活化好的荧光微球调节pH值到7.2-7.4，加入抗体∶微球比例为1∶6，30℃反应30min性能为最佳。
　　1.3、反应条件优化、性能评价及临床比对分析:确定样本稀释比例为1∶49（稀释50倍）本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为5.0-600.0IU/mL。批内精密度为8.50％，批间精密度为8.58％，分析灵敏度（检测低限）为3.22IU/mL，测试条稳定性在2～8℃环境里可存放12个月。通过样本测试比对分析，与广州南杰生物技术有限公司抗双链DNA抗体定量检测试剂盒（ELISA方法）之间具有很好的一致性，符合率＞95％，其可较好的满足临床使用的要求。
　　2、抗核抗体六联检测试剂盒研制开发
　　2.1、抗原制备:通过基因合成所需的蛋白类核抗原，并成功进行表达鉴定。
　　在NCBI上查询临床常见的人自身抗原的碱基序列和氨基酸序列，运用软件预测抗原表位，选择抗原表位并对密码子进行偏嗜性改造，采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表达载体pET30a中。将重组质粒导入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达，表达的重组蛋白用镍离子亲和层析柱纯化，用荧光免疫法测定重组蛋白活性。
　　2.2、抗原固定:对6种抗原52-kD Ro/SSA、rRNP、Jo-1、SmD1、Scl-70 SSB-La进行固定，6种抗原按1∶1∶1∶1∶1∶1混合均匀，在50℃烘箱烘干6小时，固定效果最佳。
　　2.3、荧光探针制备:鼠抗人IgG生物素标记条件优化，确定生物素:标记抗体=0.25∶1，30℃水浴30min，PH=7.2-7.4标记效果最稳定。对生物素标记抗体浓度及荧光蛋白浓度比例进行了调试，确定了最佳的配比浓度（生物素标记抗体浓度为0.4ug/mL∶荧光蛋白浓度为0.6U/L）30℃反应30min性能为最佳。
　　结论:1、本课题分析基因组双链DNA由于分子量过大容易导致NC膜层析堵塞，样本无法层析;而进行酶切处理容易导致分子大小不均一，批间差异可控度低等情况，最后选取低分子量的质粒为标记对象，采取碱裂解法提取。其纯度高，分子大小均一，批间重复性可控性好。再经过纯化、鉴定及固化、荧光蛋白与抗体的结合、测试卡的制备及组装、试剂盒反应条件优化及性能评价四项研究后成功研制了抗双链DNA(ds-DNA)抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）。该方法可以在15分钟内完成检测。确定样本稀释比例为1∶49（稀释50倍）本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为5.0-600.0IU/mL。批内精密度为8.50％，批间精密度为8.58％，分析灵敏度（检测低限）为3.22IU/ml，试纸条稳定性盒在2～8℃环境里可存放12个月。通过样本测试比对分析，与广州南杰生物技术有限公司抗双链DNA抗体定量检测试剂盒（ELISA方法）之间具有很好的一致性，符合率达到95％，其可较好的满足临床使用的要求。
　　2、应用基因工程方法利用原核表达系统成功表达了人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La等六种抗原。再经过纯化、鉴定及固化、荧光蛋白与抗体的结合、测试卡的制备及组装、试剂盒反应条件优化等初步研制了抗核抗体六联免疫层析检测方法。该方法可以在15分钟内完成检测。确定样本稀释比例为1∶99（稀释100倍）本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为10.0-500.0ug/L。批内精密度为12.53％，批间精密度为12.83％，分析灵敏度（检测低限）为8.03ug/L，试纸条稳定性盒在2～8℃环境里可存放12个月。其基本满足临床使用的要求。

目录

摘要

前言

第一部分 抗dsDNA抗体荧光免疫层析快速检测方法的建立及性能评价

一、材料和方法

二、结果与分析

三、讨论

参考文献

第二部分 六联重组自身抗原的制备及其抗核抗体联合免疫层析检测方法的初步研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

附录

研究生期间研究成果

致谢

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