羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白复合支架的制备及其用于颅骨修复的研究

摘要

骨的主要无机成分为羟基磷灰石(hyd roxyapatite，HA)，在众多生物材料中，由于纳米HA的形貌，成分，晶型和结晶度与天然骨中的骨矿物非常相似，因此其具有好的骨诱导性、骨传导性和骨整合性，成为大块骨缺陷再生方面的研究热点。此外，当HA与其他材料复合，例如天然高分子，制备成复合支架时，HA能够通过增加支架的表面特性及其粗糙度，从而促进骨细胞的活力和其增殖，有利于骨缺损部位的修复。另外，纳米材料是21世纪的研究热点，将现有的物质制备成纳米粒子，物质就会显示出不一样的性质，能够赋予材料新的性能。纳米级的骨组织修复材料具有自固化成型、机械强度高等特点，无毒无污染，优异的降解性能。纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性，能够诱导骨组织的生长发育，与骨组织细胞能够形成牢固的结构。但是羟基磷灰石的韧性不强，力学性能差，降解性能差。因此，将HA粒子与天然高分子复合制备成骨组织工程支架，能够结合天然高分子与HA粒子的优点，弥补双方的不足。
　　纳米微晶纤维素(cellulose nanocrystals，CNC)，是纤维素的衍生物，一般是通过浓硫酸水解纤维素的方法而制得，其中纤维素是自然界最普遍，最丰富的生物聚合物。纳米微晶纤维素，由于其纳米级尺寸（在至少一个维度），也常常被称为晶须，纳米晶须，纳米颗粒，纳米纤维，微晶或微晶粒。一般来说纳米微晶纤维素的宽度为2-50nm，长度为100-2000nm，具有较大的比表面积、高强度，低密度、在溶液中良好的分散性、天然无毒性、可降解，良好生物和细胞相容性等特点，同时可以被用作脱钙骨基质的载体，并在体内实验中取得良好结果。然而，粉末状的HA和CNC的低抗压强度限制了它们在非或低承重骨修复上的应用。为了提高HA和CNC的抗压强度，在制造功能支架时使HA和CNC纳米粒子在聚合物基质中均匀分布是传统的方法。陈等人制备了生物活性玻璃/壳聚糖/CMC复合材料水凝胶用于骨再生。结果表明，复合水凝胶有止血效果，并且它的生物降解性可引导骨缺陷的功能性重建。
　　丝素蛋白（silk fibroin，SF），从蚕茧中提取的一种天然高分子，拥有极好的机械强度，生物相容性，长期生物降解性以及易加工性，而且成本低廉，来源丰富。丝素蛋白是具有β片层构象的线性多肽，由于其低免疫原性、良好的生物性功能和易加工性，经常在组织工程中使用。最近有研究表明，丝素蛋白中的纳米尺寸的蛋白对生物矿化有调节作用，这是由于丝素蛋白结构中的双层片状结构存在排斥力。另外，随着丝素蛋白浓度的增加，会逐渐改变了纳米羟基磷灰石的形态。这特征使得丝素蛋白在骨缺损的修复材料中，能够充当生物矿化的模板。许多人研究了HA/SF支架用作骨缺损修复材料的可能性，结果表明HA/SF支架是一种促进骨再生的很好的材料。
　　研究表明，具有纳米拓扑结构的人工骨支架在骨再生领域中具有巨大的潜力。另外，在之前的研究当中，纳米羟基磷灰石，纳米微晶纤维素、丝素蛋白其中一种或两种的复合材料已经广泛在骨再生领域中被研究或应用;但是将三种材料复合，制备成复合支架用于骨再生领域，还没有发现有学者进行相关的研究和报道。因此，在本研究中，我们的目的是设计一种新型的生物仿生支架用于颅骨的全层缺损修复，该支架主要采用纳米非金属材料（纳米羟基磷灰石），天然高分子（纳米微晶纤维素）和蚕茧的提取物（丝素蛋白），通过一系列的制备，复合办法，并且在不添加生长因子和干细胞的情况下，制备一种具有骨诱导、骨引导，纳米拓扑结构和可降解功能的生物仿生支架。
　　第一部分 纳米羟基磷灰石肭米微晶纤维素/丝素蛋白复合支架的制备与表征
　　目的:
　　在不添加生长因子和干细胞的情况下，制备一种具有良好骨诱导和骨引导，并且可降解，生物相容性良好的骨修复组织工程支架。
　　方法:
　　首先采用水热法合成纳米羟基磷灰石，酸解法制备纳米微晶纤维素，通过蚕茧提取丝素蛋白，制备丝素蛋白溶液。随后通过物理共混和冷冻干燥的办法，制备复合支架，并对其进行一系列的表征。
　　结果:
　　在本研究中，我们首先通过水热合成法制备了针形结构的纳米羟基磷灰石颗粒，该颗粒呈针形结构，长度为100-300 nm，宽度为20-30 nm。其次，通过酸解法，利用纤维素制备了纳米微晶纤维素，该纳米微晶纤维素呈短棒状，长度约为150-350nm，宽度约为20-40nm，而且结构规整。随后，我们将纳米HA，CNC和SF溶液，经过简单的物理共混，将HA和CNC均匀分散在丝素蛋白溶液中，随后通过冷冻干燥的方法，制备了HA/CNC/SF多孔复合支架。该复合支架的微孔分布均匀，孔与孔之间的连通性好，而且孔径比较均一，平均孔径为110μm，孔隙率为90％左右，有利于成骨细胞的粘附，增殖和分化。另外，HA/CNC/SF支架具有良好的热稳定性和力学性能，压缩应力和压缩模量分别为200.7±15.3和617.5±25.2KPa。另外，通过细胞相容性测试可以知道，四种SF支架都具有良好的细胞相容性，而HA/CNC/SF支架更加有利于成骨细胞的增殖。另一方面，在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatise，ALP)的活性测试中，HA/CNC/SF支架上的小鼠原成骨细胞(MC3T3-E1)的碱性磷酸酶活性表达显著高于其他三种SF支架，证明了HA/CNC/SF支架能够更有效地促进原成骨细胞的体外成骨分化。
　　结论:
　　本研究制备的HA/CNC/SF支架具有良好的骨诱导和骨引导能力，而且细胞相容性良好，具有修复骨缺损的潜力。
　　第二部分 SF支架对大鼠颅骨全层缺损的修复
　　虽然骨有自我修复的能力，但是当骨缺损的面积超过一定的尺寸，骨的自我修复能力就大大地受到了限制，甚至是没法自我修复。因此，对于大面积的骨缺损，需要植入骨修复材料，对大面积的缺损部位进行修复。标准化的动物模型有利于我们研究复合材料对骨缺陷修复的情况。根据文献的报道，对于大鼠来说，当其颅骨的骨缺损区的直径在超过5mm的时候，该缺陷是该物种在特定的骨头没法自我修复的。
　　目的:
　　检验我们制备的HA/CNC/SF复合支架对大鼠的颅骨全层缺损模型（直径为6mm）的骨缺损的修复效果。
　　方法:
　　在制造了大鼠的颅骨缺损后，将HA/CNC/SF复合支架移植到大鼠的颅骨缺损部位。为了对比，我们也分别将SF、CNC/SF、HA/CNC/SF支架移植到大鼠的颅骨缺损部位。在特定的时间点（移植术后4W、8W、12W），采用Micro-CT测定缺损区大体修复情况、骨密度情况和组织学染色研究缺损部位新骨形成的情况。
　　结果:
　　通过Micro-CT的3D重建效果图，可以很直观地看到，随着时间的增加，四种支架对缺损部位的修复情况不一，其中SF组的修复情况最差，经过12周的修复，全层缺损的颅骨部位依旧残留很大的缺损部位没有被修复好，而其它三个组别，缺损部位的面积均较前有较明显的减小，其中HA/CNC/SF组的修复情况最理想，缺损部位被大量新生骨填充，几乎完全修复，而HA//SF组及CNC/SF缺损面积也较小，缺损处新生骨组织填充较多。另外，通过BMD数值分析可以得知，随着时间的增加，四个实验组的骨密度有所增加，其中HA/CNC/SF组的骨密度值最大，而且与正常骨的骨密度接近。另一方面，通过组织学的HE和番红固绿分析得知，在植入期间，HA/CNC/SF支架不会引起缺损部位炎症反应，具有良好的生物相容性，而且新生的骨组织已经长入支架孔内，这说明HA/CNC/SF具有良好的骨诱导和骨引导作用。此外，相对于其他三种SF支架，HA/CNC/SF支架的骨修复效果最好，术后12周，缺损部位基本完全修复，而且新生骨的形态与原始骨相似。同时，随着时间的增加，支架的降解越来越明显，术后12周，只有很少量的支架存在，新生的骨与周边骨组织结合紧密。
　　结论:
　　结果表明本实验制备的HA/CNC/SF复合支架具有可降解性和骨诱导再生能力，生物相容性良好，而且其降解速率与骨缺损部分的再生速率相匹配。
　　通过上述两部分的研究与实验，我们可以得出本实验的结论，在骨修复组织工程中，HA/CNC/SF可以作为很有潜力的一种骨缺损修复材料将来可以应用于临床治疗骨缺损。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 骨的结构和功能

1．2 骨缺损及其治疗方法

1．3 骨组织工程

1．3．1 种子细胞

1．3．2 骨组织工程支架

1．4 动物模型

1．5 课题的提出和研究方法

第二章 羟基磷灰石／纳米微晶纤维素／丝素蛋白复合支架的制备及其表征

2．1 实验部分

2．1．1 主要原料与试剂

2．1．2 丝素蛋白溶液的制备

2．1．3 纳米羟基磷灰石的制备

2．1．4 纳米微晶纤维素的制备

2．1．5 羟基磷灰石／纳米微晶纤维素／丝素蛋白复合支架的制各

2．1．6 X射线衍射测试分析(X-ray diffraction XRD)

2．1．7 傅立叶红外转换测试(FTIR)

2．1．8 透射电子显微镜(TEM)

2．1．9 扫描电子显微镜(SEM)

2．1．10 原子力电子显微镜

2．1．11 热重分析(TGA)

2．1．12 支架的力学性能测试

2．1．13 支架的孔隙率测试

2．1．14 体外细胞培养及支架的细胞相容性测试

2．1．15 碱性磷酸酶测试(ALP)

2．2 实验结果与讨论

2．2．1 HA的形貌与表征

2．2．2 CNC的形貌分析

2．2．3 FTIR分析

2．2．4 SF支架的形貌结构

2．2．5 热稳定分析(TGA)

2．2．6 力学性能分析

2．2．7 支架的细胞相容性测试

2．2．8 支架的碱性磷酸酶测试分析(ALP)

2．3 本章小结

第三章 羟基磷灰石／纳米微晶纤维素／丝素蛋白复合支架对大鼠颅骨缺损的修复

3．1 实验部分

3．1．1 主要试剂与设备

3．1．2 SF复合支架的制备

3．1．3 SF复合支架的体内移植

3．1．4 Micro-CT tomography(μcT)分析

3．1．5 组织学分析与评价

3．2 结果与讨论

3．2．1 体内骨再生的检测与分析

3．2．2 组织学染色与分析

3．3 本章小结

第四章 全文总结

4．1 总结

4．2 不足与展望

参考文献

攻读学位期间成果

中英文缩略词表

致谢

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