Pim-3对COPD气道平滑肌细胞增殖的影响及其在COPD大鼠中的潜在治疗靶点作用

摘要

本研究选取接受肺叶部分切除术患者的肺组织，根据肺功能结果分为COPD组及对照组，镜下观察小气道的气道壁及平滑肌层厚度改变，检测Pim-3的表达;体外培养ASMCs，通过RNA干扰下调PIM3表达，观察Pim-3对ASMCs增殖的影响;熏烟法复制大鼠COPD模型，用Pim激酶抑制剂AZD1208灌胃，初步观察Pim-3在COPD大鼠模型中的治疗潜能。
　　第一章 Pim-3在COPD患者肺组织中的表达
　　目的：
　　明确Pim-3在COPD患者肺组织的表达情况。
　　方法：
　　选取在本院胸外科行肺叶部分切除术的12名患者，参照COPD全球创议(GOLD2014)的诊断标准：在吸入支气管舒张剂后，FEV1/FVC小于70％诊断为COPD，把患者分为对照组(n=6)及COPD组(n=6)。获取远离瘤体的肺组织，提取两组肺组织总RNA及总蛋白，Real time PCR及Western blot检测PIM3mRNA及Pim-3蛋白的表达情况;免疫组织化学染色检测Pim-3的表达部位。肺组织行病理切片，光镜下观察肺组织及支气管形态，并使用图像分析软件分别测量气道基底膜周径(Pbm)，总管壁面积(WAt)、管壁平滑肌层面积(WAm)。所测面积均用相应的Pbm标准化，分别以WAt/Pbm、WAm/Pbm表示相应管壁及平滑肌层的厚度。
　　结果：
　　1.比较患者肺组织PIM3mRNA表达水平，见COPD组及对照组肺组织均表达PIM3;与对照组相比，COPD组患者肺组织PIM3mRNA的表达上调(T=21，P=0.002)。
　　2.比较肺组织Pim-3激酶的表达，见COPD组及对照组肺组织均表达Pim-3;COPD组患者肺组织Pim-3激酶的表达比对照组增多(T=21，P=0.002)。
　　3.肺组织病理切片镜下见对照组患者气道形态基本正常。而COPD组气道壁及平滑肌层较对照组增厚，粘膜呈锯齿样突入管腔，致管腔狭窄。
　　4.免疫组织化学染色见Pim-3主要表达于粘膜层上皮下的平滑肌层。
　　5.比较两组气道WAt/Pbm及WAm/Pbm，结果见COPD组WAt/Pbm对照组增加[(41.24±2.28vs21.30±1.98)μm2/μm，t=22.87，P＜0.001]，COPD组WAm/Pbm较对照组也增加[（10.46±0.67vs5.58±0.63）μm2/μm，t=18.40，P＜0.001]。提示与对照组患者相比，COPD组患者气道壁及平滑肌层厚度均增加。
　　结论：
　　Pim-3主要表达于气道平滑肌层，其在COPD肺组织的表达上调。
　　第二章 Pim-3对COPD患者ASMCs体外增殖的作用
　　目的：
　　明确Pim-3对COPD患者气道平滑肌细胞(ASMCs)体外增殖的作用。
　　方法：
　　选取行肺叶部分切除术的患者，按照COPD的诊断标准，分为对照组及COPD组。获取远离瘤体的肺组织，采用组织贴块法原代培养ASMCs。应用倒置相差显微镜下作细胞形态学观察，及α-actin免疫细胞化学染色鉴定细胞。把细胞分为对照组（细胞来源于对照组患者肺组织，细胞未转染）、COPD组（细胞来源于COPD组患者肺组织，细胞未转染）及COPD+NC-siRNA组（细胞来源于COPD组患者肺组织，细胞接受阴性对照序列NC-siRNA转染）及COPD+PIM3-siRNA组（细胞来源于COPD组患者肺组织，细胞接受干扰序列PIM3-siRNA转染）。以PIM3基因为靶目标，Lipofectamine TM2000转染细胞。Real time PCR检测PIM3mRNA在各组细胞中的表达，Western blot检测Pim-3及CyclinD1在各组ASMCs中的表达。MTT检测各组细胞存活，流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布。
　　结果：
　　1.倒置相差显微镜下见细胞表现为典型的“谷-峰状”排列;气道平滑肌细胞经α-actin免疫细胞化学染色后，细胞胞质呈棕黄色阳性反应，经鉴定细胞纯度达到94％以上。
　　2.Real time PCR检测PIM3mRNA的表达，Western blot检测Pim-3激酶及Cyclin D1的表达。
　　(1)比较各组细胞PIM3mRNA的表达，x2=17.65，P=0.001。两两比较后发现，与对照组相比，COPD组ASMCs中PIM3mRNA的表达上调(P=0.005);在PIM3-siRNA转染ASMCs后，Real time PCR检测沉默效率，COPD+PIM3-siRNA组PIM3mRNA的表达与COPD组相比明显下调(P=0.002)，沉默效率超过60％;与COPD组相比，COPD+NC-siRNA组PIM3mRNA的表达则无明显改变（P＞0.05）。
　　(2)比较四组细胞中Pim-3的表达，分别用Kruskal-Wallis检验，四组Pim-3：x2=18.06，P＜0.001;Cyclin D1：x2=20.72，P＜0.001。两两比较见COPD组ASMCs中Pim-3激酶表达较对照组上调(P＜0.05);在PIM3-siRNA转染ASMCs后，COPD+PIM3-siRNA组Pim-3的表达与COPD组相比均下调(P＜0.05);而COPD+NC-siRNA组Pim-3的表达则无明显改变(P＞0.05)。
　　以上结果提示COPD组气道平滑肌细胞Pim-3表达较对照组上调，PIM3-siRNA转染可有效沉默PIM3基因表达。
　　3.比较四组细胞存活，F=104.69，P＜0.001。两两比较见COPD组OD值大于对照组(COPD vs.Control：0.95±0.04vs.0.64±0.03，P＜0.001)，说明COPD组ASMCs增殖快于对照组[对照组细胞抑制率为35.90±6.68(％)]。在PIM3-siRNA转染ASMCs后，与COPD组相比，COPD+PIM3-siRNA组OD值减少(COPD+PIM3-siRNA vs.COPD：0.71±0.02vs.0.95±0.04,P＜0.001)，提示COPD+PIM3-siRNA组ASMCs细胞增殖受到抑制[抑制率为28.58±2.72(％)]。COPD组与COPD+NC-siRNA组OD值差异无统计学意义(COPD vs.COPD+NC-siRNA：0.95±0.04vs.0.92±0.04,P=0.26)。
　　结论：
　　下调Pim-3可抑制COPD患者ASMCs的体外增殖。
　　第三章 Pim-3在COPD大鼠模型中的潜在治疗靶点作用
　　目的：
　　观察Pim-3在COPD大鼠模型中的潜在治疗靶点作用。
　　方法：
　　把24只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组：COPD组（采用熏香烟法造模，不灌胃）、COPD+AZD1208组（熏香烟法造模，用AZD1208灌胃）、COPD+DMSO组（熏香烟法造模，用DMSO灌胃）及正常对照组（不熏烟、不灌胃）。Real time PCR检测COPD组大鼠肺组织中PIM家族mRNA的表达。制作四组肺组织病理学切片，镜下观察肺泡破坏情况、小气道平滑肌厚度及气道壁厚度改变。并采用平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)定量分析肺泡破坏，采用WAt/Pbm、WAm/Pbm定量分析相应管壁及平滑肌层的厚度。
　　结果：
　　1.Real time PCR检测发现，COPD大鼠肺组织中PIM1、PIM2及PIM3均有表达，以PIM3表达量最为丰富。
　　2.光镜下观察肺组织形态，见正常对照组大鼠肺泡结构正常，肺泡腔无扩大;COPD组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡壁断裂，肺泡腔扩大、融合，肺大疱形成;AZD1208灌胃干预后，COPD+AZD1208组大鼠肺泡破坏较COPD减轻，而COPD+DMSO组（溶剂对照）大鼠肺泡破坏情况与COPD组相仿。
　　3.平均内衬间隔(MLI)定量分析肺泡破坏融合情况。
　　结果显示，正常对照组、COPD组、COPD+DMSO组及COPD+AZD1208组MLI分别是：73.15±7.99(μm)、112.15±12.23(μm)、113.9±12.53（μm）及87.46±10.00(μm)。多组比较结果示：x2=177.25，P＜0.001。两两比较示：COPD组肺泡间隔比正常对照组扩大（P＜0.001）;经AZD1208处理后，COPD+AZD1208组肺泡直径较COPD减小(P＜0.001)，但仍大于正常对照组;而COPD组与COPD+DMSO组肺泡间隔差异无统计学意义(P=0.748)。
　　结论：
　　在针对COPD大鼠模型气道平滑肌层及气道壁增厚方面，Pim-3可能具有潜在治疗靶点作用。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 Pim-3在COPD患者肺组织中的表达

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论与结论

参考文献

第二章 Pim-3对COPD气道平滑肌细胞体外增殖的作用

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论与结论

参考文献

第三章 Pim-3在COPD大鼠模型中的潜在治疗靶点作用

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论与结论

参考文献

全文总结

附录缩写词中英文对照表

攻读博士期间成果

致谢

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