微囊藻毒素-LR诱导结直肠癌细胞凋亡的机制研究

摘要

目的:
　　微囊藻毒素-LR(Micr℃ystin--LR，MC-LR)是蓝藻产生的一种毒性最强的环状7肽分子，可造成严重的动物和人类肝、肾和生殖等多器官损害，危害人类健康。MC-LR通过膜转运受体OATP进入细胞，与蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A，PP2A)发生共价结合并抑制其活性，引起细胞内磷酸化水平增加和ROS产生，导致细胞骨架和DNA损伤、内质网压力、线粒体功能障碍和细胞凋亡。另外，MC-LR可激活NF-κB诱导细胞表达iNOS，并合成NO诱导胰腺细胞凋亡。NO通过蛋白质巯基亚硝基化(SNO)修饰调节细胞功能，是重要的凋亡调控因子。近来研究显示，亚硝化修饰糖酵解关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶(SNO-GAPDH)，促进GAPDH与Siah1的结合，启动了细胞核内的凋亡程序，(SNO-GAPDH-Siah1)是NO特有的细胞凋亡机制。
　　MC-LR诱导细胞产生NO，但其与MC-LR诱导的细胞毒性的相互关系还不明确。本研究通过分析MC-LR诱导NO以及SNO-GAPDH，阐明NO在MC-LR的毒性作用机制，探讨NO/SNO-GAPDH-Siah1机制在结肠癌细胞的治疗意义。另外，NO通过亚硝化修饰，调控肿瘤细胞糖酵解酶功能。而且，MC-LR可直接与糖代谢的酶结合，影响细胞代谢。因此，我们利用13C全标记的葡萄糖示踪细胞糖代谢物质，结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术，检测MC-LR对体外培养的结肠癌细胞SW480糖代谢的影响，探讨MC-LR诱导的细胞凋亡与其代谢调控之间的联系。
　　方法:
　　1.采用MTT方法，检测MC-LR对人结直肠癌细胞SW480、CaCo2、小鼠结肠癌细胞CT26、肝癌细胞HepG2、肝正常细胞LO2的细胞增殖的影响;利用Annexin-V FITC/PI双染法结合流式细胞术检测MC-LR诱导的细胞凋亡比率变化;
　　2.利用NO2-/NO3-荧光检测法，检测细胞培养基中NO2-/NO3-浓度，探究MC-LR和NOS抑制剂（L-NAME、N-PLA、1400W）对细胞NO产生的影响;应用生物素转化(biotin-switch)和免疫印迹方法(western blot)，检测MC-LR对细胞内蛋白质亚硝化水平的改变。
　　3.通过细胞核浆蛋白分离技术和免疫荧光等方法，检测MC-LR诱导细胞蛋白质核转移;
　　4.流式细胞术检测siRNA-siah1或siRNA-GAPDH、以及NOS抑制剂（L-NAME）对MC-LR诱导的细胞凋亡比率的改变。
　　5.13C-葡萄糖示踪结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术，分析MC-LR对结肠癌细胞SW480糖代谢的影响。
　　结果:
　　1.MTT检测显示，低剂量MC-LR(≤1uM)促进细胞增殖，而高剂量MC-LR(≥1uM)诱导细胞凋亡呈浓度依赖性。其中，五株细胞株SW480、CaCo2、HepG2、LO2和CT26对MC-LR毒性的敏感性不同，SW480和CT26较为敏感，而CaCo2、HepG2和LO2的细胞活性在MC-LR10uM时，未见明显异常。流式细胞术显示，MC-LR毒性主要以诱导细胞凋亡为主要形式;Western blot显示MC-LR增加SW480细胞凋亡相关蛋白Bax表达，而降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达。
　　2.Western blot实验显示，MC-LR诱导SW480中NOS1和NOS2表达;NO2-/NO3-荧光法发现MC-LR增加细胞内源性NO的产生，且MC-LR诱导的NO可被NOS1和NOS2的特异性抑制剂(N-PLA和1400W)抑制，证明MC-LR诱导细胞内NOS1和NOS2合成NO，提示NOS2可能在MC-LR诱导的NO合成中起主要作用。
　　3.Biotin-switch结合western blot结果显示，MC-LR增加GAPDH的亚硝化水平，并且NOS的抑制剂NOS1和NOS2的特异性抑制剂N-PLA和1400W都能降低能够抑制GAPDH亚硝化。核蛋白Western blot和免疫荧光结果表明，MC-LR导致GAPDH核转移，NOSs抑制剂L-NAME能够抑制其核转移，提示MC-LR诱导GAPDH亚硝化，引发其核转移。
　　4.利用siRNA干扰技术，下调Siah1或GAPDH转录后，或NOS抑制剂（L-NAME）下调NOSs的功能后，均能逆转MC-LR诱导的SW480凋亡，提示NO诱导的SNO-GAPDH-Siah1凋亡机制参与了MC-LR诱导的细胞凋亡和细胞毒性作用。
　　5.13C全标记的葡萄糖结合气相色谱-质谱技术显示，MC-LR处理后，细胞内丙酮酸和乳酸13C标记增加，TCA循环中间产物柠檬酸和天冬氨酸13C标记降低，说明MC-LR处理后抑制了TCA循环，这可能与其诱导的线粒体损伤有关。
　　结论:
　　1.与文献报道一致，MC-LR对人和鼠的多种细胞具有复杂的生物学作用，低剂量MC-LR促进细胞增殖，高剂量诱导细胞凋亡。
　　2.MC-LR刺激合成NO诱导GAPDH亚硝化，并通过SNO-GAPDH-Siah1机制诱导细胞凋亡。SNO-GAPDH-Siah1机制尚未在MC-LR的肿瘤毒性机制中报道，我们的研究为MC-LR在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。
　　3.MC-LR增加肿瘤细胞糖酵解，抑制TCA循环。MC-LR导致糖酵解增强的原因可能与其诱导的线粒体损伤，抑制细胞氧化磷酸化，导致糖酵解增加有关。

目录

摘要

前言

1．微囊藻毒素-LR及其毒性作用

2．MC-LR毒性的机制

3．MC-LR在肿瘤领域中的研究

4．MC-LR诱导细胞合成NO

5．MC-LR对肿瘤糖代谢的影响

第一节 MC-LR诱导结肠癌细胞凋亡

1．实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计分析

2．结果

2．2 高浓度MC-LR抑制细胞活性

2．3 MC-LR诱导细胞凋亡

2．4 MC-LR不增加顺铂的抗肿瘤作用

2．5 维拉帕米不能增加MC-LR的细胞毒性

3．讨论

第二节 MC-LR激活GAPDH-SNO-Siah1通路

1 材料和方法

1．1 主要实验试剂

1．2 实验方法

1．3 统计分析

2．结果

2．1 MC-LR刺激NOS1和NOS2表达和NO合成

2．2 MC-LR诱导GAPDH亚硝化

2．3 MC-LR通过SNO-GAPDH／Siah1通路诱导SW480细胞凋亡

3．讨论

第三节 MC-LR对SW480细胞糖代谢的影响

1、实验材料和方法

1．1 实验材料和方法

1．2 实验方法

2．结果

2．1．代谢物鉴定与定量

2．2 MC-LR促进糖酵解

2．2 MC-LR抑制TCA循环

3．讨论

参考文献

缩写词简表

参加国内国际会议

硕士研究生期间发表论文情况

致谢

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