基于酶修饰的蛋白质定向、共价固定化研究

摘要

蛋白酶的定向、共价固定化近年来已成为研究的热点与重要发展方向。本实验利用目前制备技术成熟、能与巯基发生特异性反应的商品化SulfoLink coupling resin为载体，以绿色荧光蛋白（GFP）为模式蛋白，将GFP与小分子酰基载体蛋白（ACP）融合表达，3,4-二溴马来酰亚胺可逆修饰蛋白表面的活性巯基后，利用holo-ACP合成酶（AcpS）对融合蛋白（ACP-目的蛋白）进行4’-磷酸泛酸巯基乙胺修饰，以4’-磷酸泛酸巯基乙胺的高活性巯基为介导，建立目的蛋白的定向、共价固定化体系，并对GFP、葡萄糖激酶（GlcK）与α-淀粉酶(Amy)固定化的动态过程进行探究，分析不同蛋白的饱和固定化量以及固定化酶的活性。
　　ACP融合蛋白的表达结果显示，ACP作为融合标签可显著促进目的蛋白GFP、GlcK与Amy在大肠杆菌内的可溶性表达；将TEV蛋白酶特异性识别位点插入到融合标签ACP与目的蛋白GlcK（Amy）之间，利用共表达的TEV蛋白酶可在大肠杆菌体内对ACP融合蛋白进行高效酶切，由此产生的目的蛋白可通过镍柱一步亲和纯化，这一表达体系极大简化了融合表达的重组蛋白的纯化步骤，降低了目的蛋白的生产成本。
　　本实验建立了ACP与目的蛋白融合表达及AcpS对融合蛋白（ACP-目的蛋白）进行4’-磷酸泛酸巯基乙胺修饰的技术体系，目的蛋白的固定化研究结果显示，holo-ACP可高效介导目的蛋白的固定化，GFP、GlcK与Amy的固定化量分别达到了9.34、5.94和5.08 mg/ml基质；目的蛋白的固定化动态过程研究显示，25℃条件下，holo-ACP融合蛋白与固定化基质在pH8.5的缓冲溶液中温浴1h，固定化基本完成，固定化条件温和，操作简便；固定化酶活性检测发现，固定化GFP在荧光显微镜下可观察到强烈的荧光，但固定化GlcK与Amy的活性均偏低，分别为各自游离态活性的23％和18%。
　　本实验初步建立了一种新型的基于酶修饰的蛋白质定向、共价固定化体系，为固定化酶的研究奠定了良好基础，在科学研究与生物转化等领域显示出良好的应用前景。

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1 前言

1.1蛋白质（酶）固定化技术研究概述

1.2 大肠杆菌表达系统研究

1.3 相关蛋白简介

1.4本研究的主要目的和主要内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 载体的构建

3.2 目的蛋白在大肠杆菌中的表达、修饰与纯化

3.3 蛋白酶的固定化研究

3.4 固定化重组蛋白活性分析

4 讨论

4.1 ACP对目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的影响

4.2 建立融合表达的目的蛋白的简便纯化体系

4.3 建立holo-ACP介导的蛋白质（酶）定向、共价固定化体系

5 结论

致谢

参考文献

附录