禽流感病毒蛋白NS1与YBX1互作影响M节段的剪切

摘要

禽流感是由甲型流感病毒引起的人畜共患疾病，近年来甲型流感病毒的阶段性爆发，造成了人类伤亡的同时也重创了家禽养殖业。甲型流感病毒属正粘病毒科，是含8个节段基因组的负链RNA病毒。其NS节段编码的非结构蛋白NS1是一种多功能蛋白，参与病毒感染期间的多个过程，包括抑制宿主的免疫反应、调节vRNA的合成、促进病毒mRNA的剪接与翻译、调节病毒复制循环等。本研究主要对NS1对病毒基因组M节段的调控机制进行了探索，发现在NS1过表达的情况下，M节段剪接产生的M2 mRNA水平显著增强，而不依赖剪接生成的M1 mRNA水平无显著性变化，初步表明NS1能促进病毒基因组M节段的剪接。
　　NS1大部分功能主要通过蛋白-蛋白或者蛋白-RNA相互作用来实现，其在病毒感染早期就大量存在于宿主细胞中，病毒mRNA剪接需要依赖宿主细胞中的剪接因子。因此我们推测NS1可能与宿主某些剪接因子存在相互作用而增强M节段的剪接。本研究采用串联亲和层析，结合LC-MS/MS质谱检测，找到多个与NS1或者NEP相互作用的宿主蛋白，包括YWHAB、RPL24、YBX1、PABPC4等。并通过免疫共沉淀实验确定剪接因子 YBX1与 NS1存在直接相互作用。免疫荧光的定位研究表明，NS1与YBX1的互作可能通过改变YBX1在细胞内的定位而发挥功能。对YBX1蛋白进行敲降后，M1与M2在mRNA水平上均存在一定程度的降低，其中M2的蛋白水平急剧下降。这初步证明了NS1与YBX1的相互作用能影响病毒基因组M节段的表达。通过截断蛋白结构域与免疫共沉淀技术，证明了 YBX1与 NS1相互作用的关键结构域是冷休克结构域。
　　综上所述，本研究通过实验找到了参与NS1调控M节段表达的剪接因子YBX1。证明了YBX1在NS1调控M节段表达的过程中发挥重要的功能，并且发挥YBX1这一功能的关键结构域是冷休克结构域。阐明NS1与YBX1的相互作用及其对M节段剪接的影响，有助于我们更清楚地了解病毒的生活史，为以NS1为靶点的药物和疫苗开发提供一些思路。

目录

声明

英文缩略词

1 前言

1.1 甲型流感病毒的基本结构

1.2 甲型流感病毒蛋白简介

1.3 NS1蛋白简介

1.4 YBX1蛋白简介

1.5 本研究目的、意义及实验总体设计

2 材料与方法

2.1 细胞株、载体、细菌菌株

2.2 主要仪器设备

2.3 实验药品

2.4 试剂盒

2.5 主要试剂

2.6 真核表达载体及其突变载体的构建

2.7 细胞复苏、培养、传代、转染和冻存

2.8 细胞总蛋白的提取、免疫共沉淀及串联亲和层析

2.9 Western-Blot免疫印迹实验

2.10 细胞总RNA提取、反转录、荧光定量PCR实验

2.11 敲降细胞系的构建与筛选

2.12 细胞表达蛋白的免疫荧光与共定位实验

3 结果与分析

3.1 禽流感蛋白真核表达载体的构建与确认

3.2 NS1影响M节段的剪接

3.3 NS1稳转细胞株的构建与筛选

3.4 NS1蛋白与宿主细胞的串联亲和层析及质谱检测

3.5 NS1蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的验证

3.6 敲降宿主细胞蛋白对NS1调控M节段表达的影响

3.7 YBX1与NS1的共定位现象及它们相互作用的主要结构域

4 讨论和总结

4.1 讨论

4.2 总结

致谢

参考文献