车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及部分性质研究

摘要

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，E．C．1.15.1.1，简称SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶。它能催化超氧离子自由基(O2-·)歧化生成O2和H2O2，使机体免受氧自由基损伤，是一种有开发前景的药用酶。迄今为止，人们已经从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、植物和动物等生物材料中分离得到SOD。 本课题探讨了从车前草中分离纯化SOD的方法并对其部分性质进行了研究。主要研究内容和结果如下： 1.分离纯化 将200g车前全草用蒸馏水洗净，进行组织破碎，再按(W：V=1：1)加入40％乙醇溶液4℃浸提4h，高速离心(12000r/min)；在提取液中加入丙酮(V：V=1：1)使SOD沉淀，静置1h，低速离心(4000r/min)；将沉淀用蒸馏水充分溶解，获得粗酶液。将粗酶液过CM-Sepharose Fast Flow柱，收集合并两个活力峰，透析、干燥浓缩后；再上Sephadex G-75凝胶柱层析，收集活力峰，冷冻干燥后得黄褐色车前草SOD0.42mg，比活851u/mg，SDS-PAGE显示为电泳纯。 2.性质研究 Cu,Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感，Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感，而Fe-SOD对氰化物不敏感，对过氧化氢敏感。1mmol/lNaCN对车前草SOD活力几乎无影响，5mmol/lH2O2使车前草SOD活力完全失活，可以判定该酶是铁超氧化物歧化酶。 SDS-聚丙烯酰胺测得车前草SOD亚基分子量约为20.1KDa。

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第一章绪论

1.1 SOD的种类及分布

1.2三种金属SOD的分子结构及活性部位

1.3 SOD的理化特性

1.3.1 SOD是亲水性的蛋白质

1.3.2 SOD半衰期

1.3.3 SOD的免疫原性

1.3.4歧化反应速度

1.3.5电离辐射对SOD的影响

1.3.6磁场对SOD的影响

1.3.7溶液介电常数对Cu，Zn-SOD活性的影响

1.3.8温度对SOD的影响

1 .3.9 pH对SOD的影响

1.3.10某些变性剂对SOD的影响

1.4 SOD活性测定方法

1.4.1物理法

1.4.2一般化学法

1.4.3光化学法

1.4.4电化学法

1.4.5电泳法

1.4.6免疫学法

1.5 SOD的分离纯化方法

1.5.1动物来源SOD的分离纯化

1.5.2植物来源SOD的分离纯化

1.5.3微生物来源SOD的分离纯化

1.6 SOD的应用

1.6.1 SOD在医疗临床中的应用

1.6.2 SOD在食品工业中的应用

1.6.3 SOD在化妆品中的应用

1.7 SOD制剂的研究

1.7.1辅助剂

1.7.2脂质体

1.7.3微胶囊

1.7.4缓释片

1.7.5合剂

1.7.5 SOD活性模拟物

1.8本课题的立题背景及研究内容

第二章材料和方法

2.1材料、主要试剂和仪器

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3常用溶液配制

2.2实验方法

2.2.1酶活力的测定

2.2.2蛋白质浓度的测定

2.2.3酶的分离纯化

第三章结果与讨论

3.1 SOD的分离纯化

3.1.1乙醇提取液浓度的确定

3.1.2乙醇提取液体积的确定

3.1.3所用丙酮体积的确定

3.1.4粗酶液的纯化

3.1.5 CM-Sepharose Fast Flow柱分离洗脱液PH值的选择

3.2酶种类的鉴定

3.3蛋白质浓度的测定

3.4 SOD活力的测定

3.5亚基分子量的测定

3.6紫外吸收性质

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢