高活力纤维素酶和木聚糖酶液态发酵及对木质纤维素的生物转化

摘要

木质纤维素生物质是地球上数量最大的一类可再生有机资源，利用生物技术将木质纤维素生物质转化为乙醇、乳酸等能源或化工产品的研究己受到全世界的普遍关注。稻草是最重要的农作物秸杆之一，在许多国家和地区，稻草资源非常丰富，尤其在中国是具有代表性的木质纤维素原料。将稻草等木质纤维素原料转化生产高附加值产品具有重要的现实意义。本论文对纤维素酶和木聚糖酶的液态发酵、粗酶液的酶学特性、稻草的酶解糖化和木质纤维素的酶解机理等进行了研究，主要的研究内容和结果如下：
　　 一、建立测定酶活的可靠实验方法和产酶培养条件的研究
　　 考察空白实验、滤纸种类、缓冲体系对滤纸酶活测定的影响，建立了简便可靠的空白实验方法，为本研究的酶活评价奠定了研究基础。对选育的一株康宁木霉QF-02进行液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶的研究。实验结果表明：碳源的种类及性质是影响产酶的关键因素；价廉易得的天然稻草是其产酶的良好碳源；培养的优化条件：40目稻草粉，Mandels营养液，起始pH值4．5，摇瓶培养144 h；所得3种酶的活力分别为：滤纸酶活1．49 FPU/mL，β-葡萄糖苷酶活0．39 IU/mL，木聚糖酶活174．1 IU/mL。
　　 二、康宁木霉发酵粗酶液主要酶学特性的研究
　　 对康宁木霉QF-02生产的纤维素酶和木聚糖酶粗酶液的主要酶学性质进行了研究。测得其中的滤纸酶、CMC酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为55℃、65℃、50℃和70℃，木聚糖酶最适温度为50℃；纤维素酶在45℃～50℃范围内具有较强的耐热性，24 h保温后的酶活保留率约50％；木聚糖酶耐热性差，45～55℃下失活都很严重。滤纸酶的最适反应pH为5．0，CMC酶和微晶纤维素酶最适pH为4．8，β-葡萄糖苷酶最适pH为4．0，木聚糖酶最适pH为4．8。与几种商品纤维素酶相比，自制酶对稻草有较强的酶解糖化能力。
　　 三、木质纤维素发酵预处理及酶解糖化条件优化的研究
　　 比较了几种常用的预处理试剂室温下对稻草的处理效果，并对稻草酶解糖化条件进行优化。研究结果表明：2％氢氧化钠溶液预处理后稻草的实际糖化率最高；自制复合酶在50℃、pH4．8时对碱预处理稻草的酶解效果最佳；从酶解效率及运行成本考虑，采用酶解时间48 h，酶载量10 FPU/g稻草，底物浓度80 g/L是合理的选择。以碱预处理稻草为原料，初步比较了分步水解发酵（SHF）和同步糖化发酵法（SSF）生产乳酸的工艺，结果表明SHF法比SSF法更为适宜，SSF法受米根霉的生长发酵温度限制，而其发酵温度很难与酶解温度协调。
　　 四、康宁木霉和米根霉混合培养产纤维素酶协同效应的研究
　　 研究发现：康宁木霉QF-02和米根霉NRRL395混合发酵生产纤维素酶和木聚糖酶的工艺中，康宁木霉先接种培养48h后再接种米根霉产酶效果最佳，在此接种方式下获得的优化培养温度为28℃，起始pH为5．0。在5L发酵罐培养的结果表明，混合培养物中滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶活和木聚糖酶活分别比纯培养提高14．8％、45．4％和4．3％。研究揭示了康宁木霉和米根霉混合发酵协同产酶的微生态原理：两种霉菌在发酵培养过程中形成了相互促进的共生关系。
　　 五、木质纤维素酶解反应机理的研究
　　 对木聚糖酶在稻草酶解糖化中的作用、纤维素酶系的构成与酶解效率的关系，酶解产物的抑制效应等酶解机理进行探讨。认为：木聚糖酶活力高的纤维素酶制剂在酶解糖化稻草时具有明显优势；纤维素酶系中，外切纤维素酶的活力是其糖化能力的主要决定因素，目前普遍采用的滤纸酶活并不能真正反映纤维素酶系的糖化能力。指出：木霉QF-02产纤维素酶时，葡萄糖浓度为12 mg/mL、纤维二糖浓度达4 mg/mL时就会产生明显的抑制效应；稻草酶解糖化时较适宜的滤纸酶活与β-葡萄糖苷酶活比值应为1/1．2左右。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 木质纤维素的酶解糖化

1.1.2 乳酸生产现状

1.1.3 木质纤维素生物转化的研究方向

1.2 国内外研究概况

1.2.1 木质纤维素的组成与结构

1.2.2 木质纤维素降解酶

1.2.3 纤维素酶和木聚糖酶的生产

1.2.4 木质纤维素的预处理

1.2.5 木质纤维素的酶解糖化

1.2.6 乳酸发酵

1.2.7 纤维素酶和木聚糖酶在其它领域的应用

1.3 选题依据及主要研究内容

第二章 滤纸酶活力测定程序中几个问题的探讨

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料

2.1.2 主要仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

2.3.2 空白实验

2.3.3 滤纸种类的影响

2.3.4 缓冲溶液的影响

2.4 本章小结

第三章 液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶的研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料

3.1.2 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 斜面培养

3.2.2 种子液培养

3.2.3 摇瓶发酵

3.2.4 检测方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 高产菌株的筛选

3.3.2 碳源对菌种产酶的影响

3.3.3 氮源对菌种产酶的影响

3.3.4 起始pH值对菌种产酶的影响

3.3.5 培养温度对菌种产酶的影响

3.3.6 接种量对菌种产酶的影响

3.3.7 通气量对菌种产酶的影响

3.3.8 培养时间对菌种产酶的影响

3.3.9 优化培养

3.4 本章小结

第四章 自制纤维素酶和木聚糖酶的部分酶学性质研究

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料

4.1.2 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 自制纤维素酶和木聚糖酶最适作用温度的测定

4.2.2 自制纤维素酶和木聚糖酶最适pH的测定

4.2.3 自制纤维素酶和木聚糖酶的热稳定性实验

4.2.4 自制酶与商品纤维素酶对稻草的酶解性能实验

4.2.5 检测方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 温度对纤维素酶和木聚糖酶活力的影响

4.3.2 纤维素酶和木聚糖酶的耐热性

4.3.3 pH值对纤维素酶和木聚糖酶活力的影响

4.3.4 自制复合酶对稻草的酶解糖化性能

4.4 本章小结

第五章 稻草预处理及酶解糖化研究

5.1 材料与仪器

5.1.1 材料

5.1.2 主要仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 稻草的预处理

5.3.2 稻草酶解糖化的优化

5.3.3 酶载量对稻草酶解糖化的影响

5.3.4 底物浓度对稻草酶解糖化的影响

5.3.5 其它因素对稻草酶解糖化的影响

5.4 本章小结

第六章 稻草生物转化生产乳酸初探

6.1 材料与仪器

6.1.1 材料

6.1.2 主要仪器

6.2 实验方法

6.2.1 菌种培养

6.2.2 稻草酶解

6.2.3 乳酸发酵

6.2.4 检测方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 纯葡萄糖与木糖的产酸发酵

6.3.2 稻草SHF法生产乳酸

6.3.3 稻草SSF法生产乳酸

6.4 本章小结

第七章 混合发酵生产纤维素酶和木聚糖酶的研究

7.1 材料与仪器

7.1.1 材料

7.1.2 主要仪器

7.2 实验方法

7.2.1 菌种培养

7.2.2 摇瓶培养

7.2.3 发酵罐培养

7.2.4 检测方法

7.3 实验结果

7.3.1 不同微生物配伍对混合发酵产酶的影响

7.3.2 接种比例对产酶的影响

7.3.3 接种先后时机对产酶的影响

7.3.4 温度对混合发酵产酶的影响

7.3.5 起始pH值对混合发酵产酶的影响

7.3.6 5L发酵罐培养

7.4 讨论

7.4.1 混合发酵产酶的微生态原理

7.4.2 康宁木霉和米根霉混合发酵产酶的共生关系

7.4.3 发酵罐培养

7.5 本章小结

第八章 木质纤维素酶解机理的探讨

8.1 材料与仪器

8.1.1 材料

8.1.2 主要仪器

8.2 实验方法

8.2.1 纤维素酶和木聚糖酶的纯化

8.2.2 稻草的酶解

8.2.3 检测方法

8.3 结果与讨论

8.3.1 木聚糖酶对木质纤维素原料酶解的影响

8.3.2 纤维素酶系组成对纤维素酶解的影响

8.3.3 葡萄糖和纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用

8.4 本章小结

结论与展望

一、结论

二、创新点

三、展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢