调肝治法方药抗慢性心理应激海马损伤作用机理的研究

摘要

第一部分理论探讨一、慢性心理应激与海马神经元损伤海马结构富含各种信使受体，尤其是高密度的皮质类固醇激素受体(corticosteroidreceptors，CR)，其密度远远高于其它脑区，在应激反应中，它不仅是HPA轴高位调节中枢，更是应激损伤的最敏感区域。 研究发现，急性应激对海马的形态结构无明显影响，但在慢性应激作用下，海马神经元会发生萎缩、甚至死亡。其具体机制尚未完全清楚，但从目前的研究结果来看，HPA-Glu-NMDAR(N-甲基-D-天冬氨酸受体)-Ca2+-NO(一氧化氮)-cGMP(环磷酸鸟苷)是应激损伤海马的一个重要的神经通路。在生理状态下，该通路发挥一系列生物学效应，最终保持神经元间兴奋性传递，维持神经元和大脑的兴奋性。 病理情况下，慢性应激造成HPA轴活动亢进、血浆GC浓度升高，高浓度的GC可引起Glu过多释放，Glu与突触后膜NMDA受体结合，引起神经元持续去极化，导致离子渗透压力和电化学改变，Ca2+通过电压依赖性钙通道或NMDA受体联结的通道内流，使细胞内Ca2+增加；Ca2+与CaM偶联并结合于胞浆中NOS相应的位点上激活NOS；后者催化NO的生成。升高的NO一方面直接通过其代谢产物ONOO-抑制Glu的摄取，加重细胞外Glu堆积；另一方面又作为逆行信使再扩散到突触前膜，与细胞内可溶性鸟苷酸环化酶活性中心的Fe2+结合，改变酶的立体构型，导致酶的活性中心增强和cGMP合成增多，通过cGMP进一步促进Glu的释放，最终也导致Glu水平显著升高。 脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一个重要成员，它对海马有重要的营养作用，参与发育期和成年期神经元的存活、分化、突触生长和形态维持。也参与形成LTP和突触可塑性，在学习记忆中起重要作用。大量的研究结果表明BDNF下调可能参与慢性应激损害海马，促进细胞凋亡。BDNF下调可增强EAA的毒性作用，诱导钙结合蛋白表达，防止大量Ca2+内流，稳定细胞内Ca2+浓度；减少NMDAR亚基合成，降低NMDAR活性；对抗NO供体的细胞毒性作用，从而防止谷氨酸的兴奋毒性作用，保护神经元免受损伤。由此推测BDNF下调可能也会通过上述路径损害海马。 二、抗应激性海马损伤的研究意义及研究概况应激性海马损伤与HPA轴功能亢进是神经内分泌系统应激反应的恶性循环结果。海马是边缘系统的重要组成部分，参与了情绪、学习记忆、行为、免疫等的调节，它的损伤会加重神经内分泌异常，在各种应激所致疾患中起到关键作用，与抑郁症、创伤后应激障碍等多种精神疾病的发病有密切的关系，并可加速脑的衰老进程。尽管目前应激性海马损伤的机制尚未完全明确，但有关其机制以及抗应激性海马损伤的研究已成为当前脑科学研究的热点。 目前大多数生物合成制剂往往只能针对单一的病理环节，有些合成技术难度较大，因此，在应用方面难免受到限制；而中药复方所表现出的整体调节作用，却显示出良好的应用开发前景。本课题组长期以来一直从事中医调肝治法方药—加味四逆散(JWSNS)防治慢性应激损伤的研究，我们以往的研究工作表明JWSNS对应激反应的NIM网络紊乱具有良好的整体调节作用。 第二部分实验研究一、材料和方法(一)药物调肝治法方药(JWSNS)组成：柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀5g、干地黄18g、石决明30g。药材广州市药材公司提供，经药剂科鉴定均为纯正药材，常规煎煮取汁后浓缩至含生药1.69g/mL。药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。 (二)动物分组及给药SPF级Wistar大鼠24只(2月龄，体重220～270g)(第一军医大实验动物中心，动物合格证号：2002-009)，雄性，体重180g～220g，按体重随机分为3组：正常组(不施加任何刺激)、慢性心理应激组(给予21d的随机应激刺激)、调肝治法方药(JWSNS)组(每次刺激前1h灌胃中药1次，每次2ml)。正常组及慢性心理应激组每次灌胃等量生理盐水。 (三)慢性心理应激动物模型制备慢性多相性应激源包括电击足底(30V，电流强度1.0mA，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共30次)、冰水游泳(4℃，5min)、夹尾(1min)、禁水(24h)、禁食(24h)、限制(2h)。以上应激刺激每天一种，随机安排在21天内。第22天取材。 二、结果(一)调肝治法方药对慢性心理应激损伤大鼠海马神经元凋亡的影响本文采用慢性心理应激模型研究大鼠海马神经元细胞凋亡的变化，揭示慢性心理应激、海马神经元细胞凋亡之间的关系，由实验的结果可以看出慢性心理应激模型可以造成海马神经元细胞凋亡，这可能是慢性心理应激引起海马损伤的机制之一，至于慢性心理应激引起细胞凋亡的原因，结合其他学者的研究结果，估计可能与GC及NO有关，故在此基础上另外观察了应激状态下大鼠海马GRmRNA及nNOS的变化；而JWSNS有明显降低海马神经元凋亡率的作用，提示JWSNS对慢性心理应激的防治作用可能是通过降低海马神经元凋亡率而完成的，这可以为临床预防和治疗抑郁性疾病提供理论参考依据和新的方法。 (二)调肝治法方药对慢性心理应激损伤大鼠海马GRmRNA表达的影响结果显示，正常大鼠海马出现大量阳性染色的神经元，阳性染色主要在神经元的胞浆，少量可见于胞核，着色较深；模型组大鼠阳性神经元减少，着色较浅；JWSNS组阳性神经元较模型组增多，着色较深。模型组大鼠GRmRNA表达明显下降，这可能是因为长期慢性心理应激导致HPA轴负反馈效应出现抵抗，可通过CRH/AVP神经元内GR的下调，产生高GC水平的耐受，GR数目减少，会使信号强度相对于GC水平变弱，导致HPA轴活动的进一步失调，而JWSNS可增加其表达，提示调肝治法方药可在应激的高位中枢海马发挥作用，诱导下降的GRmRNA表达上调，恢复HPA轴的负反馈机制，防止海马结构和功能的进一步损害。 (三)调肝治法方药对心理应激损伤大鼠海马nNOS表达的影响我们的结果表明，三组大鼠海马的CA3区锥体细胞均有nNOS表达，而应激组表达的强度显著高于正常组和应激给药组。正常组有nNOS表达，表明生理状态下海马CA3区锥体细胞也有nNOS的表达，很可能正是由于这种表达保证了低浓度NO的存在，以维持神经元的兴奋性和促进LTP的形成。应激组nNOS表达增强可能是慢性应激引起NO生成过多的原因之一。JWSNS组与模型组相比明显降低，表明调肝治法方药可以抑制慢性应激引起的nNOS表达，从而避免NO升高损害锥体细胞。Reagan等也认为，海马各亚区锥体细胞均有nNOS表达，但CA3区和门区中间神经元nNOSmRNA表达的变化与慢性应激引起海马CA3区神经元的损伤有关。 (四)调肝治法方药对心理应激损伤大鼠海马BDNF及TrkB表达的影响CREB和BDNF作为关键性介导因子在神经元存活与可塑性调节中起着核心作用，可以认为是慢性应激状态与抑郁症发生的核心介导者。BDNF下调后会引起海马神经元的萎缩甚至死亡。本研究也发现慢性心理应激组BDNF、TrkB阳性细胞减少，而JWSNS可增加BDNF、TrkB阳性细胞数。从部位来看，其起作用的部位主要在海马的齿状回颗粒层、CA3区。其中齿状回颗粒层是成年大脑保留神经发生功能的部位之一，CA3区是大量报道慢性应激状态下神经元损伤的重要部位。由此可见，调肝治法方药可以通过上调海马的BDNF表达防治应激性神经元损伤与神经元再生障碍，从而实现防治应激损伤与抑郁症作用的。 第三部分研究结论一、慢性心理应激对海马的损伤主要是导致神经元凋亡，其机制与HPA-Glu-NMDAR-Ca2+-NO-cGMP这条神经通路有关慢性应激时HPA轴活动亢进、血浆GC浓度升高，高浓度的GC可引起Glu过多释放，造成细胞外Glu堆积。Glu与突触后膜NMDA受体结合，引起神经元持续去极化，导致离子渗透压力和电化学改变，Ca2+通过电压依赖性钙通道或NMDA受体联结的通道内流，使细胞内Ca2+增加；Ca2+与CaM偶联并结合于胞浆中NOS相应的位点上激活NOS；后者催化NO的生成。升高的NO一方面直接通过其代谢产物ONOO-抑制Glu的摄取，加重细胞外Glu堆积；另一方面又作为逆行信使再扩散到突触前膜，与细胞内可溶性鸟苷酸环化酶活性中心的Fe2+结合，改变酶的立体构型，导致酶的活性中心增强和cGMP合成增多，通过cGMP进一步促进Glu的释放，最终也导致Glu水平显著升高。 二、JWSNS抗慢性心理应激海马损伤的机理主要是通过HPA-Glu-NMDAR-Ca2+-NO-cGMP这条神经通路JWSNS可以有效地抑制慢性心理应激大鼠HPA轴的兴奋性，调节血浆及中枢5-HT、DA、NE以及海马兴奋性与抑制性氨基酸的水平等的水平，降低NMDAR的表达，减少神经细胞外Ca2+内流，抑制慢性应激引起的nNOS表达过多，降低下丘脑cGMP含量，明显上调BDNF及TrkB表达，从而使易受伤的神经元得到保护。

目录

文摘

英文文摘

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引言

第一部分理论探讨

第二部分实验研究

第三部分研究结论、存在问题及研究展望

附录：常用缩略语一览表

博士在学期间发表论文情况

致谢