人胎盘CD133细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究

摘要

目的：脐带血造血干/祖细胞(HSPCs)移植后血小板恢复长期延迟，是限制脐带血移植应用的重要原因之一，体外扩增巨核系祖细胞再输入受者体内是有望解决这一难题的有效策略。本课题通过比较人胎盘组织(PT)和脐带血(UCB)CD133+细胞体外扩增巨核系祖细胞的能力，探讨HSPCs体外扩增巨核系祖细胞的新途径，同时评价CD133+细胞在巨核系祖细胞增殖分化中的意义。 方法：采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液，用Histopaque-1077从中分离出单个核细胞(MNCs)，通过磁式激活细胞分选系统(MACS)分选CD133+细胞；将纯化的人胎盘组织CD133+(PT-CD133+)细胞接种于无血清液体培养体系(含TPO、IL-3和SCF)中体外扩增巨核系祖细胞，于培养0、7、10和14天进行细胞计数，同时用胶原半固体培养法进行巨核祖细胞集落形成单位(CFU-MK)的培养；采用流式细胞术、免疫组化和瑞氏一姬姆萨染色等方法，检测分析培养过程中CD133、CD34、CD41抗原表达的动态变化、CFU-MK产率和细胞形态学特点。实验全程以脐带血作为平行比较分析。 结果：①在无血清液体培养体系中，PT和UCB细胞总数均明显扩增，至14天细胞总数分别扩增了160.1倍和116.1倍；第7、10、14天PT和UCB组的细胞总数分别为(18.88±1.23)×104、(48.70±10.74)×104、(64.04±11.92)×104和(12.24±2.36)×104、(30.85±8.05)×104、(46.42±16.60)×104，PT组在各个扩增时点的细胞总数均明显高于UCB组(P＜0.01或P＜0.05)。②在TPO+SCF+IL-3细胞因子的诱导下，PT-CD133+细胞培养至7天时，扩增效果最佳，CD133+细胞扩增了13.22±2.23倍，明显高于UCB(P＜0.01)。③培养至10天时，PT组平均每个CD133+细胞所产生的CD133+CD41+和CD34+CD41+细胞数最多，分别为2.49±0.73和2.96±0.75个，CD41+细胞为17.47±5.53个，与UCB比较均无显著性差异(P＞0.05)。④纯化的PT-CD133+和UCB-CD133+细胞在胶原半固体培养体系中均能形成CFU-MK，其产率分别为35.38±8.65/103和19.80±5.24/103个接种细胞，前者高于后者(P＜0.01)；PT和UCB-CD133+细胞扩增后再作半固体培养，均能形成CFU-MK，但其形成率随扩增时间延长均呈进行性下降，两者扩增后各个时间点上的CFU-MK形成率均无显著性差异(P＞0.05)；PT和UCBCFU-MK的扩增数均于第10天达到峰值，分别扩增了54.13±10.48和59.45±11.83倍，两者比较无显著性差异(P＞0.05)。⑤无论PT组还是UCB组，从CD133+HSPC到巨核细胞(MK)的分化，其细胞表型的变化都经历了一个更替的演变过程，即培养的初始表型主要为CD133+CD41-、CD34+CD41-，随着培养时间延长，CD133+CD41+、CD34+CD41+细胞亚群逐渐增多，至14d时CD34+CD41+细胞亚群仍可保留约1％，而CD133+CD41+细胞亚群基本消失，几乎完全演变为CD133-CD41+细胞亚群。⑥SAP染色和瑞氏一姬姆萨染色显示，扩增后的巨核系细胞多呈幼稚状态，未见血小板形成。 结论：①本研究首次发现，人PT-CD133+细胞具有向巨核系祖细胞增殖分化的潜能，其增殖能力总体上优于UCB-CD133+细胞，而其分化特点则与UCB-CD133+细胞相似。这为人胎盘作为HSPCs移植的供体资源提供了新的实验证据。②本实验结果揭示，CD133+细胞是研究巨核系祖细胞增殖分化的较好的生物模式。这有助于HSPCs谱系发育生物学的研究。③根据实验结果，首次提出了巨核系祖细胞增殖分化上的表型谱即CD133+CD41-→CD133+CD41+?→CD34+CD41+→CD133-CD41+。这一工作假说有待进一步证明。

目录

摘要

前 言

一、材料和方法

二、结 果

三、讨 论

四、结 论

参考文献

致 谢

英文缩写词

[综 述]巨核系祖细胞体外扩增的研究进展