富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞在病变牙根表面的附着及胶原形成的研究

摘要

目的：研究不同浓度的富血小板血浆(Platelate-Rich plasma,PRP)对牙周膜成纤维细胞(Peridontal fibroblasts,PDLFs)在脱矿的病变牙根表面的附着，以及富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞在脱矿的病变牙根表面形成胶原的影响。以进一步探讨富血小板血浆在促牙周组织再生中的作用。 方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞，并进行传代，取5～8代细胞用于实验。富血小板血浆的制备采用二步密度梯度离心法，取人新鲜全血(已加入抗凝剂)第一次离心(1300r/min)10分钟，吸取全部上清液及交界面以下1～2mm的沉淀部分移至另一离心管，弃去下层沉淀部分，再次离心(2000r/min)10min，获取下层为富血小板血浆(PRP)，弃去上层为贫血小板血浆(PPP)。将制备一部分富血小板血浆吸取于EP管，贮存在-20℃环境下，为实验处理脱矿根片时备用，将另一部分制备的富血小板血浆与10％CacL2和牛凝血酶以9:1(V/V)混合，4℃冰箱过夜，待血凝块充分收缩后，低温下，再次离心(10000r/min)10分钟，吸取上清液于EP管，贮存在-20℃环境下，用于调节不同浓度的PRP备用。病变牙根片的制备，取因重度牙周病拔除的病牙，拔除前用铅笔在牙根表面标记出牙周袋累及的范围，然后用刮治器刮净牙根面上残留的组织，并在冷水冷却的条件下用金刚砂片将牙根磨成4×4mm2大小，1mm厚(只磨出牙本质侧，牙骨质侧不磨)的牙根片，收集的根片经高压处理后留存待用。处理的脱矿病变牙根片，根片的处理方法是EDTA(24％，PH=6.7)脱钙加PRP5μl包被。本实验主要分两部分来完成：1、检测不同浓度PRP对入PDLFs在处理的脱矿病变牙根表面的附着情况。实验分组：(1)实验组A组10％PRP培养基、B组15％PRP培养基、C组20％PRP培养基、D组30％PRP培养基；(根片均用PRP5μl包被)(2)对照组E组DMEM培养基(根片无PRP包被)。首先将脱矿的病变牙根片用双面胶固定在96孔培养板中，按实验分组分别预处理收集的病变牙根片，紫外线照射30分钟，然后加入2×105/ml细胞的相应培养液，标准环境下孵育4h后，采用四唑盐比色法[3-(4，5-dimethyiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]测定细胞附着情况。方法是每孔加入20μlMTT，继续孵育4h，吸弃孔内上清液，轻轻取去牙骨质块，用PBS液轻轻漂洗两次，另置于96孔板，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡5分钟，酶标仪测定各孔OD值。2、观察富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞在脱矿的病变牙根表面胶原的形成情况。将处理的脱矿病变牙根片固定在48孔培养板中，然后加入含3×104细胞浓度悬液的相应培养液。实验分组：(1)实验组A组20％PRP培养基(根片包被约PRP5μl)。(2)对照组B组DMEM培养基(根片无PRP包被)，继续培养2周，每2-3天按相应培养液换液。2周后对两组实验采用扫描电镜观察细胞在病变根片表面附着，生长状态以及胶原形成的情况。用天狼星红组织特染的方法进一步观察病变根片表面胶原形成的情况。 结论：浓度为20％PRP为促进PDLFs在脱矿处理的病变牙根表面附着的最佳浓度，并能促进其在处理的脱矿的病变牙根表面胶原的形成。推测PRP和根面脱矿处理在牙周再生中起重要作用。

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综述 基底膜蛋白多糖和硫酸乙酰素在牙周组织再生中的作用

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