缺血后处理对大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱的影响

摘要

目的:
　　 建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察缺血后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤心脏功能的影响。利用蛋白质组学研究技术，观察缺血后处理大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱的变化，寻找缺血后处理的作用靶点，为临床应用提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型，将18只健康雄性成年Sprague—Dawley大鼠随机分为正常组(Nor)、缺血再灌注损伤组(I/R)、缺血后处理组(IPO)，每组6只;各组具体灌注方案:Nor组:持续灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)120 min，无缺血再灌注损伤。I/R组、IPO组，缺血前灌注K-H液平衡20 min后，灌注4℃ST.Thomas停跳液，使全心停跳缺血40 min，分别按以下方案续灌:I/R组:灌注K-H液60 min; IPO组:先复灌K-H液10s、停灌10s，循环6次，再续灌K-H液58min。记录各组平衡末和续灌末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等指标的变化，并收集大鼠心肌组织供线粒体提取用。
　　 2、差速离心及Nycodenz密度梯度离心提取、纯化大鼠心肌线粒体，并利用透射电镜方法对大鼠心肌线粒体进行纯度与完整性鉴定。
　　 3、提取心肌线粒体蛋白质，采用双向电泳技术(2-DE)对蛋白质进行分离，染色、凝胶扫描后获得2-DE图像，利用PDQuest8.0软件分析各组蛋白质表达的差异。选取差异在2倍以上的蛋白质点，并将各蛋白点挖取、酶解、采用MALDI-TOF-MS鉴定，获得相关差异蛋白质谱图;
　　 4、利用Western blot验证部分差异蛋白的表达趋势，以判断2-DE结果的可靠性。
　　 结果:
　　 1、平衡末各组间心功能无明显差异，续灌末Nor组和IPO组心功能明显优于Con组（P＜0.05）;
　　 2、应用Nycodenz密度梯度离心法分离和纯化的大鼠心室肌线粒体，利用透射电子显微镜可证实该法能在不影响线粒体结构和完整性的情况下，可进一步提高了线粒体的富集度及纯度。
　　 3、对各组线粒体蛋白进行2-DE，获得聚焦良好、相似性高及显色清晰的2-DE图谱，每张胶上检测出495±23个蛋白质斑点;PDQuest8.0软件分析获得3个差异蛋白，将蛋白点行胶内酶解、MALDI-TOF-MS分析，均成功鉴定;
　　 4、Nor组与Con组比较发现:SSP5805(SDHA，Succinate dehydrogenase[ubiquinone]flavoprotein subunit，mitochondrial precursor;琥珀酸脱氢酶—黄素蛋白)蛋白表达水平升高。Con组与IPO组比较发现:SSP1507(NDUFV1，NADH dehydrogenase(ubiquinone) flavoprotein1;NADH脱氢酶黄素蛋白1）及SSP2706(DLDH，dihydrolipoyl dehydrogenase，mitochondrial precursor;二氢硫辛酸脱氢酶)表达升高。
　　 5、差异蛋白NDUFV1和DLDH行Western blot验证的结果显示:在IPO组中NDUFV1和DLDH的表达高于Con组（P＜0.05），这些蛋白质的表达变化与2-D结果一致。
　　 结论:
　　 1.缺血后处理能减轻心肌缺血/再灌注损伤，具有保护缺血心肌和改善心功能的作用。
　　 2.缺血后处理可能通过上调NADH脱氢酶黄素蛋白1和二氢硫辛酸脱氢酶的表达，以此来维系线粒体呼吸链的稳定和三羧酸循环的正常进行，促进有氧代谢，保持心功能稳定。
　　 3.应用Nycodenz密度梯度离心法能对心肌线粒体起到很好的富集效果。

目录

声明

英汉缩略词对照表

摘要

前言

1．材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂和设备

2．方法

2．1 Langendorff离体心脏灌注模型

2．1．1 试剂配制

2．1．2 建立模型

2．1．3 实验动物分组

2．1．4 灌注方案

2．1．5 心功能测定

2．1．6 数据分析

2．2 心肌线粒体的分离、纯化

2．2．1 主要试剂配制

2．2．2 大鼠心肌线粒体分离和纯化

2．2．3 心肌线粒体纯度和完整性的检测

2．3 双向凝胶电泳(2-DE)

2．3．1 试剂配制

2．3．2 心肌线粒体蛋白的提取、纯化及定量

2．4 NDUFV1、DLDH差异蛋白western blot验证

3．结果

3．1 心功能比较

3．2 线粒体纯度验证

3．3 透射电镜检测心肌线粒体纯度与完整性结果

3．4 双向电泳凝胶图像的PD-Quest分析

3．5 质谱鉴定及蛋白数据库检索

3．6 差异蛋白NDUFV1和DLDH的Western blot验证

4．讨论

4．1 线粒体的分离、完整性及纯度验证

4．2 缺血后处理与心肌保护

4．3 缺血后处理与线粒体差异蛋白

4．3．1 Nor组与Con组比较

4．3．2 Con组与IPO组比较

4．3．3 小结

5．结论

参考文献

综述

致谢

作者简介