不同来源的EPCs对NSCs增殖分化的影响

摘要

本文分析了不同来源的EPCs对NSCs增殖分化的影响。本研究分为三个部分：
　　第一部分：不同胎龄SD胎鼠脊髓源性NSCs特性的比较。
　　目的：探究不同胎龄SD胎鼠脊髓源性NSCs增殖分化能力的差异。
　　方法：将选取的不同孕龄的SD孕鼠随机分为3组：A组（孕12d）、B组（孕14d）、C组（孕16d）。采用酶消化法结合机械分离法提取脊髓源性NSCs，检测不同时间点各组NSCs神经球的直径和数量，通过CCK-8法绘制各组NSCs的生长曲线。Brd-U和Nestin免疫荧光染色鉴定各组NSCs的增殖特性和神经干细胞属性。10％FBS诱导分化后行β-tubulinⅢ、GFAP免疫荧光染色分别鉴定诱导分化后的神经元和星形胶质细胞，比较各组NSCs诱导分化的神经元、星形胶质细胞和原浆型星形胶质细胞的比例。
　　结果：各组NSCs Brdu、Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP免疫荧光染色均为阳性。B组神经元细胞的分化比例在三组中最高(22.74±0.79)%；后两组NSCs神经球直径和数量以及神经元的分化比例第一组(P<0.05)。第3代NSCs培养第5天B组细胞OD值(0.5107±0.0272)高于C组(P<0.05)。
　　结论：采用机械分离法结合酶消化法获取的脊髓源性NSCs在体外培养环境中增殖活力强，性质稳定；E14天取材培养的NSCs在体外生物学性质稳定，细胞的增殖活力旺盛，诱导后分化为神经元的分化比例高于E12d和E16d。
　　第二部分：SD胎鼠脑源性NSCs和脊髓源性NSCs增殖分化能力的比较。
　　目的：比较SD胎鼠脑源性NSCs和脊髓源性NSCs在体外培养环境中增殖分化能力的差异。
　　方法：采用酶消化法结合机械分离法提取孕14天SD胎鼠脑源性NSCs和脊髓源性NSCs，通过Nestin和Brd-U鉴定NSCs的神经干细胞属性和增殖特性，检测比较各组NSCs神经球的直径和数量，采用CCK-8法绘制细胞曲线，比较不同来源NSCs的生长活力。10%FBS诱导后对分化细胞行β-TubulinⅢ和GFAP免疫荧光染色分别鉴定神经元和星形胶质细胞。比较两组神经元、星形胶质细胞和原浆型星形胶质细胞的分化比例。
　　结果：两种来源的NSCs对Nestin和Brd-U免疫荧光染色均呈阳性反应；两组NSCs诱导后均可分化β-TubulinⅢ阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。脑源性NSCs诱导分化后神经元比例（27.56±0.79）%较脊髓源性NSCs（25.58±0.72）%相比差异有统计学意义（P<0.05），但是后者诱导分化后原浆型星形胶质细胞的比例（53.09±2.88）%则明显高于脑源性NSCs（50.60±2.88）%（P<0.05）。
　　结论：脑源性NSCs分化后神经元的比例高于脊髓源性NSCs，而原浆型星形胶质细胞的分化比例后者高于前者。
　　第三部分：骨髓源性EPCs和外周血源性EPCs对NSCs的生物学作用。
　　目的：探究骨髓和外周血来源的EPCs对神经干细胞增殖分化能力的影响。
　　方法：采用密度梯度离心法结合差速贴壁分离法提取SD大鼠外周血源性EPCs和骨髓源性EPCs。通过酶消化法结合机械分离法获得孕14d SD胎鼠脊髓源性NSCs。之后将EPCs接种于Transwell小室上层，NSCs位于下层，分为3组：A组，外周血源性EPCs+NSCs；B组，骨髓源性EPCs+NSCs；C组，DMEM条件培养基+NSCs。通过摄取Dil-acLDL、结合FITC-UEA-1实验及CD34和vWF免疫荧光鉴定EPCs。Nestin/β-tubulin-Ⅲ/GFAP免疫荧光染色鉴定NSCs。检测各组一周内不同时间点神经球的直径和数量，采用CCK-8法绘制各组NSCs的生长曲线；10%FBS诱导分化后行β-tubulin-Ⅲ免疫荧光染色检测各组神经元分化比例，GFAP免疫荧光染色检测星形胶质细胞和原浆型星形胶质细胞的分化比例。
　　结果：来自外周血和骨髓的两种不同来源的EPCs均能够吞噬Dil-acLDL，也能结合FITC-UEA-1。CD34和vWF免疫荧光染色均为阳性。A组和B组NSCs在体外培养环境中增殖能力均高于C组（P<0.05）；诱导后B组神经元的分化比例（27.37±0.80）%和原浆型星形胶质细胞的分化比例（53.78±2.37）%高于A组和C组（P<0.05）。
　　结论：骨髓源性EPCs较外周血源性EPCs更能促进脊髓源性NSCs向神经元和原浆型星形胶质细胞分化。