抗氧化剂原花色素对蘑菇酪氨酸酶活性的影响及机理研究

摘要

原花色素是一类具有生理生化活性且广泛存在于植物树干、叶子和果实中的多酚物质。因此，原花色素是药品开发的良好来源。酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是一种广泛分布于自然界的含铜离子的氧化还原酶。在人体中酪氨酸酶的异常表达能引起雀斑和黑色素沉积等皮肤病。最近有研究表明酪氨酸酶与帕金森综合症及其他神经衰弱疾病相关。此外，酪氨酸酶在昆虫的蜕皮及果蔬褐变中也起了关键的作用。因此，酪氨酸酶抑制剂在农业、工业、制药业尤其是在化妆品行业中有重要开发价值。
　　本课题首先运用响应曲面法对黄葛树树叶多酚的提取条件进行优化，采用总酚提取率(EAP)、总黄酮提取率(EAF)、DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力(FRAP)为优化指标。单因素实验结果表明，温度、乙醇浓度、提取时间和提取次数是多酚提取的主要影响因素，且这些信息被用于后续的中心组合实验设计中。响应曲面的实验结果能很好的被二元方程拟合，拟合度高达98％。通过拟合得到的总酚提取率、总黄酮提取率、DPPH自由基清除能力和FRAP的最佳提取条件。在综合考虑这四个指标后得出的最优提取条件为:乙醇浓度58％、温度57℃、时间37min和重复提取3次。此外，我们还发现EAP、EAF与抗氧化能力有很强的线性相关。
　　我们进一步采用13C核磁共振、反相高效液相色谱—质谱联用和基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术研究了黄葛树树叶、果实和树皮，鱼尾葵果皮和果肉以及印度塔树树叶原花色素的结构组成。除印度塔树树叶原花色素只包含原花青定外，其它种类的原花色素都同时含有原翠雀定和原花青定且以B型连接相连。质谱最高峰之间相距质量分数为288Da，这对应一个儿茶素/表儿茶素单元。MALDI-TOF-MS检测到黄葛树树叶、果实和树皮原花色素的聚合度分布分别为三到六聚体、三到十二聚体和三到十五聚体，印度塔树树叶原花色素的聚合度由三到十四聚体。此外，除了印度塔树树叶原花色素外其他原花色素结构在每个最高峰旁边还出现质量分数相差16Da的小峰，这种峰的出现表明组成这些多聚体的单体的B环结构上仅存在一个羟基。同时，在鱼尾葵果肉原花色素的质谱峰中还出现一系列相差272Da的峰，这表明鱼尾葵果肉原花色素存在只由阿福豆素/表阿福豆素相连形成的均聚体。
　　我们通过DPPH、ABTS自由基清除能力以及FRAP法进一步探讨黄葛树树叶、果实和树皮，鱼尾葵果皮和果肉以及印度塔树树叶原花色素的抗氧化能力。黄葛树中黄葛树树皮原花色素具有抗氧化能力最强，其DPPH和ABTS自由基清除能力的IC50分别为109.20±0.99和80.82±3.31μg/mL，其FRAP值为688.34±24.14毫克维C当量每克干重(mgAAE/gd.w.)。鱼尾葵果皮原花色素比鱼尾葵果肉原花色素抗氧化活性更强，他们的DPPH和ABTS自由基清除能力分别为142.86±1.53和80.51±0.4μg/mL以及157.42±1.87和83.18±1.22μg/mL，其FRAP值分别为373.09±5.02和317.91±13.06mgAAE/gd.w.。印度塔树树叶原花色素的DPPH和ABTS自由基清除能力的IC50分别为89.32±12.07和76.79±5.88μg/mL，FRAP值为710.54±142.82mgAAE/gd.w.。对原花色素的结构与抗氧化活性关系的分析表明原花色素B环的3'羟基对抗氧化力起增强作用。
　　我们进一步对黄葛树树叶、果实和树皮，鱼尾葵果皮和果肉以及印度塔树树叶原花色素对蘑菇酪氨酸酶活性的影响进行研究。而且对黄葛树树叶、果实和树皮原花色素对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制机理和动力学进行分析。同时，我们采用荧光猝灭、铜离子相互作用和分子对接技术探讨黄葛树树叶、果实和树皮原花色素对酪氨酸酶的抑制机理。黄葛树树叶、果实和树皮原花色素对酪氨酸酶都有很强的抑制作用（特别是果实原花色素）且属于混合型抑制剂。黄葛树树叶、果实和树皮原花色素对蘑菇酪氨酸酶单酚酶的IC50值分别为131.67、99.89和106.22μg/mL;对双酚酶的IC50值分别为128.42±0.45、43.07±0.62和74.27±0.68μg/mL。抑制机理研究表明黄葛树树叶、果实和树皮原花色素可能通过与酪氨酸酶活性中心的铜离子螯合而抑制酶活。此外，黄葛树树叶、果实和树皮原花色素还能还原酪氨酸酶的氧化产物多巴醌。鱼尾葵果皮原花色素具有抑制酪氨酸酶的作用，而鱼尾葵果肉原花色素则含有大量表儿茶素（酪氨酸酶的二酚酶底物）。印度塔树树叶原花色素对双酚酶的IC50值为773.09±1.47μg/mL。
　　总之，通过本课题的研究，分离纯化得到高效酪氨酸酶抑制剂原花色素，并对原花色素的化学结构、抗氧化活性以及对酪氨酸酶活性抑制的分子机理进行分析，为开发原花色素为抗氧化剂和美白化妆品奠定了理论基础。

目录

声明

英文缩略表

摘要

第一章 前言

1．1 原花色素的研究

1．1．1 原花色素的概念和分类

1．1．2 植物样品的储存及原花色素的提取、分离与纯化

1．1．3 原花色素的定量分析

1．1．4 原花色素的结构分析

1．1．5 原花色素的抗氧化活性

1．2 酪氨酸酶的研究

1．2．1 酪氨酸酶的结构

1．2．2 酪氨酸酶抑制剂的研究

1．2．3 酪氨酸酶抑制剂的应用

1．3 本课题的研究内容与研究意义

第二章 响应曲面法优化多酚提取条件

2．1 实验部分

2．1．1 仪器

2．1．2 材料与试剂

2．1．3 实验方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 单因素条件优化

2．2．2 响应曲面法优化

2．3 小结

第三章 原花色素结构解析

3．1 实验部分

3．1．1 仪器

3．1．2 材料与试剂

3．1．3 原花色素的提取与纯化

3．2 结果与讨论

3．2．1 原花色素的液体13C NMR分析

3．2．2 降解产物HPLC-ESI-MS分析

3．2．3 原花色素的MALDI-TOF-MS分析

3．3 小结

第四章 原花色素的抗氧化活性分析

4．1 实验部分

4．1．1 仪器

4．1．2 材料与试剂

4．1．3 实验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 植物样品的总酚含量

4．2．2 原花色素总酚含量的比较

4．2．3 原花色素总黄酮含量的比较

4．2．4 FRAP抗氧化能力的比较

4．2．5 DPPH自由基清除率的比较

4．2．6 ABTS自由基清除率的比较

4．2．7 原花色素结构与抗氧化活性的关系

4．3 小结

第五章 原花色素对酪氨酸酶活性的影响

5．1 实验部分

5．1．1 仪器

5．1．2 材料与试剂

5．1．3 实验方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 原花色素对蘑菇酪氨酸酶活性的影响及酶抑制机理

5．2．2 荧光淬灭法研究原花色素对蘑菇酪氨酸酶的作用机理

5．2．3 紫外可见光谱分析原花色素对酪氨酸酶的作用机理

5．2．4 配体与酪氨酸酶模型的对接研究

5．3 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

硕士期间发表论文及所获荣誉

致谢