Lc-MS/MS法测定猪内脏、肌肉和尿液中Neu5Ac、Neu5Gc和KDN含量以及膳食摄入唾液酸与疾病关系的探讨

摘要

近年来，大量的流行病学资料显示，人类长期食用哺乳动物源“红肉”（牛肉、猪肉和羊肉等）增加癌症等疾病的发生风险。研究表明:从红肉中摄取的Neu5Gc和疾病，如癌症、心血管疾病和炎症性疾病等有着密切的关系。哺乳动物源性红肉含有丰富的Neu5Gc，吸收的部分可以通过血液分布到整个身体组织。而猪肉是人们饮食中红肉的主要来源之一，含有丰富的蛋白质和重要的微量元素。在中国75％的红肉来源于猪肉，猪的内脏中含有丰富的铁、锌等微量元素和维生素A、维生素B2和维生素D，能够有效的补充人体对这些物质需要。中国人饮食传统中不仅摄取猪瘦肉，还包括猪内脏，如心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏。关于红肉中唾液酸报道越来越多，然而猪内脏的唾液酸的分布以及含量尚不清楚。本研究从器官水平分析了唾液酸在猪内脏和肌肉中唾液酸含量的变化，探讨了Neu5Gc和疾病的关系。
　　Neu5Ac是母乳的重要组成成分，在婴幼儿的大脑发育和学习记忆方面发挥重要作用。婴幼儿体内唾液酸的一个重要来源就是母乳或者配方奶，其在体内的代谢情况还不清楚。考虑到尿液是唾液酸排泄的主要途径，我们选用仔猪为模型，模拟婴幼儿膳食摄入不同的Neu5Ac后，研究尿液中唾液酸的含量，分析Neu5Ac的摄入量与唾液酸排泄量的关系，同时探讨尿液中唾液酸与疾病的关联性。
　　第一部分 LC-MS/MS法测定猪的不同年龄阶段和不同体系中Neu5Ac, Neu5Gc,KDN含量以及膳食摄入Neu5Gc与疾病的关系
　　目的:测定不同年龄阶段猪瘦肉和猪内脏（心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏）Neu5Ac、Neu5Gc和KDN分布和浓度，分析唾液酸含量与年龄的关系;同时比较了生肉和煮熟的肉中Neu5Gc的含量，为人类的饮食提供参考，更好的理解红肉中的Neu5Gc的摄取和癌症之间的关系。
　　方法:采用LC-MS/MS的分析方法测定猪脾脏、肾脏、肺、心脏、肝脏和肌肉中Neu5Ac、Neu5Gc和KDN的含量。
　　结果:(1)3日龄、38日龄和成年猪内脏组织——肺中总唾液酸的含量最高，分别为14.6±1.4μmol/g protein，8.6±0.8μmol/g protein和7.8±0.7μmol/g protein;而肌肉组织在3个年龄段唾液酸的含量最低（3.9±0.2μmol/g protein，2.7±0.3μmol/g protein，0.8±0.04μmol/g protein）;(2)3日龄猪和成年猪总唾液酸含量从高到低依次为肺、心脏、脾脏、肾脏，肝脏和肌肉，38日龄猪中依次为肺，肝脏，脾脏，肾脏，肌肉和心脏;在成年猪中唾液酸在内脏和肌肉中的含量排序与3日龄猪相同;(3)在脾脏中结合态Neu5Gc是唾液酸最主要的形式，相对含量约63～75％，肺中Neu5Gc的含量约为47％，其它组织中Neu5Gc的含量约占总唾液酸含量6～33％;肾脏、心脏、肝脏和肌肉中结合态Neu5Ac是唾液酸的主要形态(57～77％); KDN主要以游离态存在，游离态和结合态KDN二者之和占总唾液酸的百分比不到5％;(4)随着年龄增长唾液酸的含量逐渐下降，成年后猪内脏和肌肉组织中的唾液酸与3日龄猪相比下降了44～79％;(5)煮熟后的内脏肉，唾液酸含量是原来的2倍，而肌肉约为原来的4倍，在6个组织中含量依然最低。
　　结论:从器官水平上分析，唾液酸随着年龄的增长含量逐渐下降，因此唾液酸的含量的变化，可以作为年龄鉴定的一个有用的生物学指标，膳食摄入猪瘦肉的Neu5Gc的含量比猪内脏肉低的多，选择摄入猪瘦肉比猪内脏肉更安全。
　　第二部分 仔猪尿液中唾液酸含量与饮食摄入唾液酸的关系以及疾病关联性研究
　　目的:本研究通过膳食添加不同含量和不同形态唾液酸，测定38日龄仔猪尿液中唾液酸的含量，存在形态及百分分布，探究尿液中唾液酸的含量及分布与膳食摄入量之间的关系。
　　方法:根据唾液酸的含量，将3日龄36头仔猪分为四组，分别为:对照组:配方奶中不额外添加的乳糖结合的Neu5Ac(77.7mg/100g);实验组一:额外添加蛋白结合的Neu5Ac(601.8mg/100g);实验组二:额外添加乳糖结合的Neu5Ac(486.8mg/100g);实验组三:额外添加等量的蛋白结合的Neu5Ac和乳糖结合的Neu5Ac以及0.5g/L的乳铁蛋白，Neu5Ac的总含量为439.1mg/100g。配方奶中其他成分均相同。将3日龄仔猪随机分入四组，喂养到38天，取仔猪尿液，用液相色谱-质谱联用法测定四组仔猪尿液中唾液酸含量，分析膳食摄入唾液酸的量和尿液中唾液酸的排泄量的关系。
　　结果:(1)四个分析组仔猪尿液中总唾液酸的含量分别为149～195mmol/mol Cr,112～173mmol/mol Cr,150～180mmol/mol Cr,140～174mmol/mol Cr;(2)仔猪尿液中唾液酸由Neu5Ac、Neu5Gc和KDN组成，结合态的Neu5Ac最高(40～51％)，其次为游离态Neu5Ac(17～25％)和结合态Neu5Gc(16～19％)，两者含量没有统计学意义(P＞0.05)，再次为游离态Neu5Gc(10～14％)，KDN含量最低，结合态KDN比游离态KDN略高，二者之和占总唾液酸不到5％;(3)由于人的尿液中不含Neu5Gc，主要为Neu5Ac和微量的KDN，仔猪尿液中各唾液酸的百分分布与人相比，差异性较大;(4)长期膳食摄入Neu5Ac的含量与尿液中唾液酸的排出量并无相关性，推测可能对尿液中唾液酸的排出量的构成比造成影响。
　　结论:四个实验组中尿液中的唾液酸的含量均无显著性差异(P＞0.05)，实验组一，尿液中游离的Neu5Ac百分含量明显高于其实验组二和实验组三(P＜0.05);膳食添加不同含量的蛋白结合和乳糖结合Neu5Ac与尿液中Neu5Gc、Neu5AC和KDN的排出量并无相关性。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一部分 LC-MS／MS法测定不同年龄阶段猪的不同系统的Neu5Ac，Neu5Gc，KDN含量以及膳食摄入Neu5Gc与疾病的关系

第1章 前言

1．1 唾液酸

1．2 人体Neu5Gc与疾病的关系

1．3 红肉与人类健康的关系

1．4 唾液酸的检测方法

1．5 本论文的研究目的、内容和意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料与仪器

2．2 样本制备

2．3 检测条件

2．4 方法学考察

2．5 数据处理

第3章 结果与分析

3．1 实验条件的优化

3．2 方法的评价

3．3 结果分析

第4章 结论与讨论

4．1 猪不同年龄段不同脏器中唾液酸含量分析

4．2 内脏肉中Neu5Gc和疾病关系的探讨

4．3 生和熟猪内脏和肌肉中唾液酸含量的分析

4．4 Neu5Gc在除人以外的其它哺乳中体内的作用

4．5 总结与展望

第二部分 仔猪尿液中唾液酸的含量与饮食摄入唾液酸的关系以及疾病关联性探讨

第1章 前言

1．1 唾液酸在体液中的分布

1．2 唾液酸的合成

1．3 唾液酸的吸收代谢

1．4 唾液酸对大脑发育的影响及对哺乳期婴儿的作用

1．5 测定尿液中唾液酸的临床意义

1．6 仔猪模型

第2章 材料与方法

2．1 实验用配方奶的制备

2．2 仔猪的饲养

2．3 尿液采集

2．4 LC-MS／MS法分析尿液中唾液酸的含量

2．5 尿液中唾液酸浓度的分析

2．6 尿液中肌酐浓度分析

2．7 统计学分析

第3章 结果与分析

3．1 猪尿液中唾液酸浓度

3．2 仔猪尿液中游离态和结合态Neu5Ac、Neu5Gc和KDN的分布

3．3 仔猪尿液中唾液酸含量与饮食摄入唾液酸含量关系

第4章 结论与讨论

4．1 仔猪尿液中唾液酸浓度和分布分析

4．2 膳食摄入唾液酸量与尿液中唾液酸排出量的相关性

4．3 总结

参考文献

致谢